划痕实验技巧分享 & Livecyte在划痕实验上的应用

划痕实验技巧分享 & Livecyte在划痕实验上的应用

5月18号，我们邀请到Phasefocus公司的高级生物应用科学家Dr. Rakesh Suman，来自Univeristy of Hull的教授Mat. Hardman以及Liz Robert介绍了Livecyte在划痕实验上的应用，同时也分享了使用Livecyte在研究组织修复方面的实际应用。我们整理了研讨会中关注度比较高的几个问题，供各位做划痕实验，细胞迁移的老师同学参考。当然，如果您刚好手上有样品，又想要做Demo实验探索划痕实验的新世界，欢迎联系秦女士：138-1827-3779。

（网络研讨会视频插入）

Livecyte网络研讨会-问答列表：

Q: Livecyte用来拍摄细胞最长做过多长时间？细胞到实验最后还活着吗？

Rakesh：我们用Livecyte拍摄过原代海马神经元，这是一种非常敏感的原代细胞。在拍摄这种细胞时，我们一共对细胞进行了7个整天的拍摄，每6分钟拍摄一次，细胞依然很健康。理论上讲，只要您的细胞还在生长，您就可以使用Livecyte系统进行连续几周的拍摄，直到您觉得需要更换培养基为止。

Q: 划痕实验和间隙封闭法（exclusion assays）在研究细胞迁移上有什么区别，哪一种方法更好？

Mat：这要看您最终想要看什么，以及你的实验目的是什么。如果你做的是划痕实验，你对细胞进行了损伤，那么这个实验是你引入了创伤的因素导致的细胞迁移。但是在间隙封闭法（exclusion assays）里，实验是通过移除掉细胞生长障碍物得到一块空白区域，然后观察细胞的迁移。这时会发现细胞会往空白区域移动的更快，而且这种实验方法也没有任何的损伤因素。所以，不能说哪一种方法更好，他们是解决两个不同问题的不同方法。

Q: 在实验中得到统一整齐的划痕的最好的方法是什么？

Liz and Mat.首先，多练习是最重要的，划痕划的越多，当然就会更整齐。这其次再是一些做划痕的小技巧：

l  尽量的使枪头跟板底保持垂直，不要有任何角度。

l  铺细胞时要注意孔和孔之间细胞的密度相同。另外，要避免细胞密度太满，否则一开始做划痕，非划痕区域的细胞也被带走了。

l  可以利用板子边缘的孔来练手，练习的时候尽量的将线划直，并且尽量让他们统一。

l  注意下手的力度，你需要尽量的在每个孔都使用同样的力度去做划痕。

l  如果你做的是间隙封闭法，你只需要直接往孔里面铺细胞就行了。当你移除掉阻塞物后，你可以直接得到整齐统一的划痕。

l  在Livecyte的系统里面，划痕的宽度可以从零时间点开始就被监测到。这使得你可以从一开始就分析出每个实验组之间起始划痕的不一样，而不是像终点法一样只能观察到一段时间之后划痕的愈合情况。

Q: 在划痕实验里面，你用的是什么样的细胞，我们可以通过这个实验验证疤痕形成吗?

Rakesh. : Phasefocus在研发过程中尝试了很多种细胞系。刚才PPT里面我们用的是MDA-231 转移性乳腺癌细胞。由于Livecyte在拍摄过程中的光毒性几乎可以忽略，所以我们一些客户也用它来研究原代细胞。

Mat. 划痕实验其实不是特别适用于研究疤痕形成，因为疤痕形成本质上来讲是基质沉积和代谢的过程。但是你可以选择在基质上面培养细胞并且展开划痕实验，并且用从伤口处得来的原代细胞在基质上培养。疤痕形成的另一个原因是成纤维细胞的分化，那么你可以用Livecyte来定量监测成纤维细胞在疤痕形成中是如何分化的。

Q：有百分之多少的划痕愈合被定量检测到了？

Rakesh：我们检测划痕愈合的方法是先计算划痕初始面积，然后在每个时间点计算剩下的面积占初始面积的百分比。在整个愈合过程中，初始的划痕面积是100%，在划痕愈合过后会变为0%。

Mat：检测划痕面积的愈合实在最基本的，Livecyte给我们提供了划痕实验中一个全新的检测方向-检测单个细胞在划痕愈合过程中的行为。其他通用的方法不能做到这么细致，无法研究在整理细胞迁移的过程中单个细胞的行为形态变化。

Q:为什么说Livevyte在划痕实验中研究前缘细胞（leading edge cells）以及后两排细胞是意义的？

Mat: 大家在做划痕实验时，特别用上皮细胞时，其实是想看前面的细胞朝划痕区域移动的有多快。但是那也只是在研究细胞怎么移动，划痕怎么愈合。当你把上皮细胞做出一条划痕时，前面的细胞被去除掉了，也等同于通知了后排细胞他们需要做出一点改变。这些后排细胞需要被激活，并开始朝划痕的方向移动。那么细胞此时需要改变他们的粘连方式和形态使得他们的移动可以促使划痕的愈合。所以如果你可以研究前缘细胞以及随后的一两排细胞，你就可以知道细胞是如何通过改变形态来实现细胞迁移的。

Q：Livecyte最大的成像视野是多大，必须是正方形的吗？

Rakesh. Livecyte最大的成像面积是2 x 2mm (2000 x 2000 microns)。视野（FOV）也不必是正方形，可以自己定义大小和形状（正方形和长方形），最长的地方可以做2mm。同时一个孔内我们可以选择多个视野来拍摄，所以你可以选择尽量多的前缘区域进行拍摄。