一、研究背景

脓毒症（Sepsis）是由病原微生物侵入人体引起的全身炎症反应综合征（Systemic  inflammatory response syndrome, SIRS），常见于重症监护病房（Intensive Care Unit， ICU），死亡率高达 30%～50%。脓毒症是由宿主对感染的反应失调，反应表现为丧失特异性，功能紊乱，导致多器官衰竭等症状并且病死率高，延迟诊断及治疗会显著增加脓毒症患者住院时间，导致抗生素的滥用，增加医疗费用。及时识别诊断进行早期治疗对脓毒症患者的预后具有非常重要的意义。

白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）正常人体生理浓度很低（＜10 pg/mL），受到感染后IL-6水平会迅速升高，并且这种升高发生的时间比 PCT 早得多。1小时内开始升高，2小时后可达高峰，由于 IL-6出现时间早，具有高敏感、高特异性等优点，可以被用于脓毒症的早期诊断，是脓毒症可行性生物标志物。

 利用上海如海光电生产的Portman785拉曼光谱仪并采用三明治夹心法原理的方法（实验原理如图1所示），制备嵌有拉曼报告分子的金核银壳基底材料（Au@4MBA@Ag NPs），通过标记抗体，检测时与抗原形成双抗夹心结构，之后利用链霉亲和素（Streptavidin，SA）和生物素系统（SA-Biotin）特定的反应，夹心结构迅速被SA磁珠捕获，通过外部施加磁场富集磁珠，拉曼激光器自下而上检测双抗夹心复合物的拉曼信号强度实现高灵敏定量检测。

图1 SERS磁反应检测白细胞介素-6实验原理图

二、研究内容

1. Au、Au@4MBA及Au@4MBA@Ag 拉曼光谱分析

在激光功率为200 mW，积分时间为2 s，1次时，分别检测制备的Au、Au@4MBA及Au@4MBA@Ag的拉曼信号，其中4MBA的浓度为10mM，观察其拉曼信号的强弱，从而选择具有SERS效应的纳米粒子。如图 2所示。Au NPs本身不具备拉曼信号，添加拉曼报告分子4MBA形成Au@4MBA时，拉曼信号也无明显增强，但包裹银壳在Au@4MBA外层形成核壳结构Au@4MBA@Ag后拉曼信号显著增强，为高灵敏度检测提供了良好基础。

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图2 Au、Au@4MBA and Au@4MBA@Ag 的拉曼光谱图

2. 磁免疫体系的优化

因偶联物的用量将会影响检测的灵敏度，需要考察偶联物的最佳配比，取 IL-6系列标准溶液0 pg/mL、10 pg/mL和500 pg/mL，各吸取100 µL于微型小孔中，分别加入3 µL Au@4MBA@Ag-15H5示踪偶联物及0.03，0.1，0.2，0.3，0.4 µL Biotin-19D6捕获偶联物于恒温震荡仪中孵育反应 5 min，随后加入 40 µL SA磁珠后继续震荡反应 10 min，进行拉曼检测。应选择既能满足临床检测的灵敏度，又能在 IL-6质量浓度范围内测得拉曼信号变化大，区别最明显的反应体系。

如图3所示，当捕获偶联物用量为0.1 µL，拉曼信号在0 pg/mL和10 pg/mL之间有明显的变化趋势，满足临床灵敏度的检测要求，同时，质量浓度为500 pg/mL拉曼信号区别最明显。故确定最佳体系为3 µL Au@4MBA@Ag-15H5 示踪偶联物和0.1 µL Biotin-19D6捕获偶联物。

图3 白细胞介素-6检测磁免疫体系的优化

3. 不同浓度的IL-6拉曼光谱图及标准曲线

利用建立的双抗夹心磁免疫表面增强拉曼散射法分别对不同浓度的IL-6系列标准溶液进行拉曼检测并采集信号，得到的拉曼光谱如图4a所示。IL-6的标准曲线方程为y=-57404x² + 184903x + 2408.4，r= 0.9997。图4b表明，IL-6在0.0~1000.0 pg/mL范围内与拉曼信号响应值具有良好的相关性。

图4 IL-6 的拉曼光谱图(a)及标准曲线(b)

4. 临床对比实验

分别使用本测定方法和临床使用的化学发光法对 57 例临床血清样本进行测试对比。采用SPSS16.0软件进行配对t检验和一元直线回归分析，配对t检验结果t=0.985、P=0.329 >0.05，表明两种方法无统计学差异，线性回归方程为 y = 0.9757x + 5.9323，相关系数 r=0.9896，P<0.01，结果如图6所示，两者相关性良好。因此，与行业标准使用的化学发光法相比，基于 SERS 在血清中定量检测 IL-6 表现出令人满意的性能。

图5 SERS与化学发光临床检测对比

三、结论

利用Portman 785拉曼光谱仪并采用三明治夹心法原理的方法检测血清中的白细胞介素-6的浓度，具有灵敏度更高、操作简单、选择性好、无需清洗以及检测时间仅需15 min等优点，不仅适用于血清中IL-6的高灵敏度定量检测，也为脓毒症生物标志物的检测提供新的技术参考，也可以为日益严格的临床检测提供实践参考，具有良好的应用前景和实用价值。

四、文献来源

五、产品推荐