脐血干细胞的生物学特性及其应用

脐血human cord blood hcB）又称胎盘血或脐带血，是在足月胎儿娩出之后，经结扎脐带断脐，通过脐静脉穿刺或切开引流收集到的残存在胎盘和脐带中的血液。脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞。脐血干细胞是近年发现的一类具有与骨髓干细胞，外周血干细胞相同的多向分化潜能的原始祖细胞。脐血干细胞具备自我更新和增殖的能力，并能在特定因素的影响或诱导下，向各种细胞或组织分化。作为骨髓及外周血干细胞的替代物，脐血干细胞在临床上的应用与脐血干细胞的生物学特性密切相关干细胞的定义及分类干细胞是能够自我更新并具有向任何组织及器官分化潜能的未分化细胞。就分子生物学技术角度而言，干细胞将会有广阔的应用前景。干细胞分为胚胎干细胞、脐血干细胞和成人干细胞。每种干细胞各有自己的特性，并可根据其基因分型及表型的标记不同进一步细分_1]。
　　胚胎干细胞是无性并具有自我更新潜力的细胞，可以向任何特殊的细胞类型转化 。胚胎干细胞来源于原始胚胎的有丝分裂，被认为是全能干细胞的完美代表。大约处于5-6 d有丝分裂的人胚胎内的细胞群是多功能性胚胎干细胞的来源。这些可以向多个器官和组织分化的干细胞称为多能干细胞[23。
　　有关胚胎干细胞的研究受法律及伦理约束。
　　脐血干细胞分离自新生儿脐带血。脐血干细胞是具有自我更新潜力的多功能干细胞。可以分化为各种组织和器官的细胞体系，比如软骨细胞系、脂肪细胞系、成骨细胞系、骨髓组织及血液组成成分等。
　　当应用于细胞移植时，脐血干细胞比成人干细胞有两大优势，一是易获得性，二是移植物抗宿主病的发病率较低，这是脐血中干细胞比较幼稚、免疫耐受性较高的结果。所以，脐血干细胞更适用于治疗损害的组织及免疫失调的疾病。
　　成人干细胞也具有向多种组织及器官分化的潜力，但目前其特性及分类标准还是根据其所在组织或器官内部的自我更新及分化能力判断。
　　人脐血（UCB）人脐带中平均含有60～80 mL血液，在分娩后用采血袋取血_3]，这种方法比其他采血方法的污染率降低大约15％。脐血被认为是各种干细胞的来源 ]。
　　因此，UCB中含有可以分化为红细胞、白细胞及血小板的特殊干细胞，并具有外周血干细胞及骨髓干细胞所不具备的特殊选择性的能力。UCB中还富含调节T细胞，可以耐受同种免疫排斥反应。故脐血干细胞（UCB—SCs）较外周血干细胞及骨髓干细胞具有更令人振奋的应用前景人OGB—SCs鉴于人UCB的组成成分，有必要分清以下各种干细胞，如无限制成体干细胞、问充质干细胞、造血干细胞及内皮祖细胞¨5]。脐血干细胞在培养第4 5天时，显微镜下观察呈成纤维细胞样改变。人UCB含有较高比例的细胞标记物。如CD34 及CD105+_4].
　　这是其具有较高再生能力的原因之一。与骨髓干细胞相比，UCB—SCs在体外培养过程中更倾向于形成集落，并需要多种不同的定向分化诱导因子。故UCB—SCs更适用于再生医学的研究。UCB—SCs高度保守的端粒，更长的端粒长度，长时间较高的稳定性及较低的致癌率使其较骨髓源基质细胞更适合于实验及临床研究 ]。
　　
　　一、脐血源无限制成体细胞（USSC）在人UCB中有一类CD45一及HLAⅡ一的细胞，其在脐血中含量较少，但在体外培养时表现出强大的增殖能力，即使在数目增殖至10 时，仍能保持稳定的多向分化能力。这类细胞就是USSC[ 。其可以向中胚层、内胚层及外胚层定向分化，分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂细胞及神经细胞等。在体外培养中不表达CD14，CD33，CD34。CD45，CD50和CD106，而表达CD13，CD29，CD44，CD90，CD105和波性蛋白及某些特殊标记，如Runx1，YB1及KDR等 ]。脐血中这类无限制成体细胞可能是脐血中造血祖细胞、间充质祖细胞及内皮祖细胞的来源。
　
　　二、脐血源间充质干细胞（CB MSOs）脐血中的CB—MSCs被认为是用于移植的最佳选择。深入研究证实，CB—MSCs可分化为软骨细胞、骨细胞、脂细胞、神经细胞及脏壁中胚层。CB.MSCs在体外培养过程中不表达CD14，CD34和CD45。而表达CD106，CD54，SH2，SH3和SH4[ 。电子光学显微镜下观察可以看到CB—MSCs中某些间质标记物表达阳性，如SMA、波形蛋白、巢蛋白及结蛋白[ 。CB.MSCs还表达一种特殊的标记H0X，尤其是HOXA9。HOXB7，HOXC10及HOXD8被称为问充质干细胞的“生物学指纹”[9]，这是从脐血中分离间充质干细胞的特异性标记之一。
　　
　　三、脐血源造血干细胞（CB—HSCs）目前CB—MSCs被认为是移植治疗血液系统疾病的最佳选择。正如可以分化为血液组成成分一样，CB.MSCs也可分化为骨髓组织的组成成分 ]。鉴于造血作用的传统定义，可以认为CB.MSCs与原始的造血祖细胞相似。有研究证实，CB—MSCs在培养过程中极易形成集落，并表达各种细胞因子，如P21apl／wafl，P27 pl，Stat3， ，Notch，Ⅵ t，GSK_3，H0X 家族（如Hoxb4），FoxO，pu.1，GATA一1，HIF一1仅和Rheb2d等，这些细胞因子与UCB—SCs的一系列功能，如细胞存活、细胞自我更新、增殖、分化及迁移等密切相关_】……四、脐血源内皮祖细胞（CB—EPCs）CB—EPCs最适合在血管重塑过程中整合人新生血管的再生过程并定向分化为血管内皮细胞 1 。末梢血中EPCs的数目较少，不能进行细胞疗法。脐血中有大量的具有功能并可以在体外培养增殖的EPCs。CB—EPCs的临床应用需要在可控制条件下扩增并有严格的临床前实验证实。在体外培养基培养总是以集落单位的形式存在，通过细胞磁性进行筛选。CB.EPCs表达CD1337CD34 或KDRVCD34 或相关VEGFR2和CD14一，还表达STAT3、c_kit、CXCR4和Oct4Ira]。
　　UCB—SCs移植的临床应用1989年首例UCB—SCs移植成功，受者为患有范科尼贫血的男孩，供者是与其HLA匹配的姐妹_1引。
　　2008年是首例UCB.SCs移植成功的20周年口 ，纵观20余年的不断发展。至今超过20 000例恶性及非恶性患者已经成功地实施了UCB.SCs移植[】 ，其中恶性疾病包括急慢性骨髓、淋巴系统疾病及脊髓发育不良综合征等一系列恶性肿瘤[1 ；非恶性疾病主要有骨髓功能衰竭和血红蛋白病、代谢性疾病、脑白质营养不良症[19 和原发性免疫缺陷性疾病等_加]。但目前脐血干细胞仍以用于移植治疗血液系统恶性疾病为主[21]。评价UCB—SCs应用于非血液系统疾病的弊与利取决于很多因素。如受者疾病的状态、供者的功能状态、供者的可行性及移植物的特性。脐血干细胞在血液系统的应用评价取决于嗜中性粒细胞及血小板数目的恢复情况。即分别连续3 d不少于500个／mm 和即使在未行血小板输入的情况下也不能少于20 000个／ram l21]。Rocha等 研究发现，与骨髓干细胞移植患者相比，UCB—SCs移植者移植后的第1个月嗜中性粒细胞及血小板恢复较慢。因此，UCB—SCs移植者的免疫功能恢复延迟，容易引发感染E23]，但UCB—SCs移植后急慢性移植物抗宿主病（GVHD）的发病率明显降低。一项多中心的前瞻性研究发现，34例脐血干细胞移植患者中90％发生了病原体的感染。2／3的患者在移植后的前6个月至少有3种病原体的感染，而移植100 d后原有疾病的复发率降低 ]。大量研究发现，脐血干细胞移植治疗血液系统疾病后可明显降低移植相关死亡率（TRM）和疾病复发率，且允许HLA的不完全匹配，故脐血干细胞已成为替代骨髓干细胞移植的新选择[2“。成人进行UCB.SCs移植后的TRM、移植失败率、总死亡率及复发率与骨髓干细胞移植相比的结果同儿童相似，但UCB—SCs移植应用于成人的最大障碍是脐血干细胞数目不足。目前研究者正在不断探索尝试新的方法及策略。~I3UCB—SCs体外扩增及移植入双份UCB—SCs等。Barker等E25]已证实双份UCB.SCs移植的安全性和有效性。国内也有双份HLA不全相合非血缘脐带血干细胞（CBT）成功治疗成人重症白血病的报道E262。
　　移植的UCB—SCs通过多种细胞因子与微环境相互作用以达到彼此适应，微环境中基质细胞产生的趋化因子1（SDF一1／CXCL12）及其受体、CXCR4等对移植后干细胞的趋化、归巢、活化及存活均起着重要的作用[27-281。最新的研究证实，UCB—SCs可依靠Got介导的信号机制成功植入骨髓微环境内 ，其中转化生长因子p（TGF—p）E28]、血小板生成素及其受体和MPL是诱导干细胞减少细胞分裂而处于静止期的骨髓信号分子的候选因子。也有学者报道。Nf2／Merl可以通过影响微环境来调节移植的UCB—SCs的功能口0]。
　　故移植成功与否与植入的微环境密切相关。这是UCB.SCs移植的关键所在。Broxmeyer等。 研究发现，可以通过减少微环境中抑制干细胞归巢的细胞因子数目、增加前列腺素E：含量、使移植干细胞岩藻糖基化、增加移植干细胞数目等提高移植干细胞的归巢及移植成功率。
　　
　　UCB—SCs移植在再生医学的应用脐血中非造血干细胞只能分离自新鲜的脐血。
　　这是因为其在冻存的脐血中含量较低的缘故。理论上USSC可以在体内外增殖达lO 仍能保持自身多向分化能力的稳定性[6 3。UCB—SCs的这些特性使组织再生研究成为可能。
　　一、用于心脏疾病的研究细胞培养及动物实验证明，获得自新鲜脐血的干细胞可以缓解心脏的创伤，其可以迁移至心肌梗死区，减小心肌梗死范围，提高心肌功能，增加心肌毛细血管密度。Leor等口 ]应用CD133 UCB—SC进行移植研究，发现可使MI裸鼠模型的心肌梗死可得到明显改善。体外实验研究发现，非造血干细胞可以分化为心肌细胞E34]。动物模型心肌梗死范围的缩小可能与某些细胞因子的产生密切相关。为减少心肌梗死的并发症， 自体骨髓干细胞移植已成功应用于临床实践，认为其机制仍与细胞因子的释放相关。
　　UCB.SC移植治疗心肌梗死还需要大量临床试验研究。
　　二、内分泌紊乱及糖尿病UCB.SCs可以移植治疗免疫缺陷性疾病。目前无论是临床前实验研究还是临床研究大都集中于UCB—SCs移植治疗l型糖尿病（Tra M）。有文献报道15例接受自体造血干细胞治疗的患者中，14例治疗后停用胰岛素，最长者已达35个月_3 。2006年南京大学医学院附属鼓楼医院进行了国内首例造血干细胞移植治疗TIDM，迄今患者已停用胰岛素20个月余，血糖一直维持在正常水平 。Haller等|37]对15例行自体UCB.SCs移植治疗的T1DM患者进行1年随访，发现患者的自身免疫性抗体滴度、CD4／CD8、其他T细胞表型无明显改变，而CD4+,CD25~.FoxP3+（Tregs）在移植后6个月明显升高；UCB—SCs移植后1年，尽管自身比较发现患者有一段时间C.肽短暂升高，但并没有与移植相关的不利事件发生。但因为缺乏对照，此结果还有待证实。UCB—SCs移植治疗T1DM的疗效仍需进一步临床试验证实。
　　三、神经障碍性疾病大量的动物模型实验证实。UCB—SCs移植可以明显改善神经损伤的进展，如卒中、肌萎缩（ALS）、帕金森病、阿尔茨海默病及脊髓损伤。目前已经有诱导UCB—SCs向受损的神经组织分化的临床试验。大量临床试验证实，UCB.SCs移植是一种新的首选治疗方法[38]。
　　UCB—SCs移植治疗的优缺点UCB—SCs为干细胞移植开创了新的篇章，其具有以下特点。优点：①UCB.SCs的易获得且对供者无危险。② 与骨髓及外周血干细胞相比。UCB中的造血干细胞及间充质干细胞表达的CD34 、CD105 水平较高。（~）UCB-SCs移植前宿主抗排斥反应的处理较轻。④其具有的较强的免疫耐受力。使受者GVHD的发病率较低。⑤UCB中调节T细胞具有较高效能。⑥UCB—SCs移植后受者抗移植物白血病的发病率较低。@HLA匹配的自由度较高，为那些少数民族及老年患者提供了治疗的机会。缺点：①UCB捐献者数量有限。②uCB中干细胞数目较骨髓及外周血少。③临床试验随访的时间不够长。@UCB—SCs所带有的先天性基因缺陷可能会转移给受者。