Northern杂交分析法

(一)原理

    Northern杂交(Northern blotting)是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。

    Northern杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：①完整mRNA的分离；②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离；③将RNA转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA在凝胶中的相对分布；④将RNA固定到支持物上；⑤固相RNA与探针分子杂交；⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子；⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。

(二)材料

1．待检测的RNA及制备好的探针。

2．试剂DEPC、琼脂糖(电泳级)、MOPS电泳缓冲液(10×和l×)、37％甲醛溶液(pH>4)、甲酰胺、甲醛加样缓冲液、SSC(10×、20×、l×、0．25×)、10mg／ml溴化乙啶、Northern杂交溶液、N0rthern杂交溶液、O．1％SDS DEPC处理的双蒸水。

3．仪器及器材60℃水浴箱、平台式摇床、硝酸纤维素膜、滤纸、杂交袋、电泳装置和放射自显影所需试剂和设备。

(三)方法

1．凝胶或甲醛凝胶的准备

(1)配制1．2％琼脂糖凝胶：将4．2g琼脂糖加入304．5ml水中(用500ml角烧瓶)，放入微波炉内溶化后，置于60℃水浴中(凝胶量应根据所需制备的凝胶板大小来决定，一般是20cm×20cm的凝胶板)。

(2)当琼脂糖凝胶凉至60℃时，加入35ml 10×MOPS电泳缓冲液，并加入10．5ml37％甲醛溶液，充分混匀。

(3)准备好电泳槽，并将加样孔成形梳插入，使梳顶端与槽底约有1mm距离，倒入上述甲醛琼脂糖凝胶溶液，冷却30～45min，小心抽出梳子，加人1×MOPS电泳缓冲液，淹没凝胶表面(加样孔大小约10 mm×lmm，以便能加入约60ul样品)。

2．RNA电泳及转移

(1)混合液的配制：用5p110×MOPS电泳缓冲液、8．755μl37％甲醛、25μl甲酰胺。

(2)将RNA样品加入混合液中，最后加水至50μl，最好每种RNA样品做一重复对照：一种RNA样品的用量为O．5～1．Oμl，如果待测的RNA在总RNA中含量较高，可以直接用总RNA为样品(如<0．05％)，否则用Poly(A)+RNA代替。

(3)充分混匀样品，离心5～10s，在55℃中温育15min。

(4)每种样品加入10μl甲醛加样缓冲液，混匀并离心，立即加样。

(5)5V／cm电泳3h，待二甲苯蓝指示剂泳动到凝胶的一半距离时结束电泳。

(6)将完成电泳后的凝胶直接转移到一大盘内，用DEPC理的双蒸水漂洗数次，以除去甲醛(转移用RNA凝胶不用EB染色，而重复对照组可用EB染色，并与标准RNA的分子量对照)。

(7)倒出漂洗液，加入500ml 10×SSC盘中，将盘置于平台式摇床上轻摇45min。

(8)将凝胶块置于塑料胶片上，测量胶块的长与宽，然后再将胶块放人lO×SSC中。

(9)剪下比胶块约小3mm的一块硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜在盘中浸湿约1min，

然后再将膜放入20×SSC中5～10min。操作时应戴手套，防止手上的油脂污染膜面。

(10)将凝胶块左下角切去，以便定位。准备一玻璃平台，置于一装有20×SSC的大盘之中，在平台上铺上一层滤纸(Whatman 3mm滤纸)，此纸要比胶块宽约2cm、长30～40cm，使纸两端浸入台下的20×SSC之中，排除滤纸与玻璃板之间的气泡。

(11)从lO×SSC中轻轻移出凝胶块，沥干表面水分，并将其平铺在玻璃平台的滤纸上(注意，不要在凝胶与滤纸之间形成气泡)。将硝酸纤维素膜从20×SSC中取出，平铺在胶块的表面，剪去左下角(注意：硝酸纤维素膜的面积不要大于胶块，也不能在膜与胶块之间形成气泡)。

(12)将准备好的吸水滤纸2～3张放入20×SSC中浸湿，然后置于吸水纸上，吸干多余水分，将其铺在硝酸纤维素膜上(注意：这一叠纸的面积不能超过下面硝酸纤维素膜，四周最好留出2～3mm，纸与膜之间不能存在气泡)。

(13)在第一层吸水纸之上，放上比层析纸稍小的一叠吸水纸(5～8cm厚)，再存吸水纸上加一块玻璃板，其上可以压上约500g的重物。转移液在吸水纸的虹吸作用下从容器中转移到吸水纸上，从而带动凝胶中小的RNA转移到硝酸纤维素膜上。

(14)用保鲜膜将盛有转移液的盘于盖上，减少蒸发作用。需要保持转移时间6～24h，其问更换吸水纸1～2次。

(15)用镊子除去层析纸，将硝酸纤维素膜置于一张干燥滤纸上，用记号笔标明加样孔的位置。

(16)硝酸纤维素膜用6M×SSC浸泡5min，以去掉琼脂糖块。

(17)干燥硝酸纤维素膜，将其置于两层干燥滤纸之间，70～80℃烘干下2h。

(18)此硝酸纤维素膜可以用于下一步杂交反应，也可用铝箔包好，室温下真空中保存备用。

3．预杂交、杂交和洗膜

(1)将烘干的硝酸纤维素膜放人一个可以封口的杂交袋内，加入6～10ml Northern预杂交溶液(量的多少根据纤维素膜的大小而定)。封闭杂交袋(预杂交液应加入袋底层，排除其中气泡，用封口机将袋口封牢)。前后摇动袋子数次，以使硝酸纤维素膜充分湿润。

(2)于37～42℃恒温水浴箱中过夜，保温过程中不时将杂交袋摇动数次。

(3)将准备好的放射性或非放射性标记探针置入6～10ml Northern杂交液中，取此液6～10ml，煮沸探针5min，然后加入Northern杂交液混匀。

(4)将杂交袋剪开一个小口，倒出预杂交液，最好将袋放在一平面台上，用10 ml加样器头轻挤压一下。

(5)加入杂交液与探针混合液，使之在膜上分布均匀，然后再次排出气泡，密封袋口。为防止放射性污染，可以在袋外再加套一个保护袋。

(6)置于37～42℃恒温水浴箱中过夜。

(7)次日剪开袋口，取出硝酸纤维素膜，洗膜。方法如下：用1×SSC加入O．1％SDS，室温下洗2次，每次15min，然后再加入O．25×SSC(含O．1％SDS)，室温下洗2次，每次15min。

(8)在室温下．硝酸纤维素膜用O．1×SSC稍稍漂洗，用层析纸吸去硝酸纤维素膜上多余水分。进行放射自显影．一般经过24h后可在x线胶片上显现RNA条带。如系非放射性标记探针，可用酶或荧光染色分析。

(四)注意事项

1．N0rthern杂交分析常因检测的RNA质量不高而失败。因此，在进行Northein杂交分析之前，可以先对RNA样品进行电泳，并用EB染色以检测其质量好坏。经过RNA电泳证明其质量较好，而在N0rthern杂交中未能反映出清晰的RNA条带，可能的原因是：①甲醛的pH太低。②制备电泳凝胶时溶液未能充分混匀。

2．在放射自显影中出现高背景和模糊的RNA条带时，可能是因为：①杂交的滤膜未能彻底清洗干净。②未烤干滤膜时RNA可能出现溢散现象。③在RNA转移到固相支持膜上时，有空气泡存在于介质之间。④探针的质量不好。