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SDS-PAGE 胶染色
SDS-PAGE 胶染色
一、各种蛋白染色方法的灵敏度比较
二、考马斯亮蓝染色
CBB 染色液
0.5%考马斯亮蓝 G250 或 R250
40%甲醇
10%乙酸
将 CBB 溶于甲醇中并不停的搅拌 15min。加入乙酸与 ddH2O
脱色液：30%甲醇
10%乙酸 染色方法：1.在摇床上染色 30min.
2.脱色至蛋白点或条带清晰可见
3. ddH2O 洗 3-5 次
三、胶体考马氏亮蓝染色 Colloidal Coomassie Staining （Cambridge centre for porteomics ）
sensitivity = ~100ng
1. 固定：甲醇/醋酸/H2 O(45:1:54) 至少 20min.
2. 染色 12-18hr。
染色液： 17% (w/v) 硫酸铵
34%甲醇
0.5%醋酸
0.1% (w/v) Coomassie G250
3. 脱色：用 H2O 脱色至蛋白点和背景清晰.
双向电泳蛋白点的切取和保存
1. 用 PDQuest 软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。
2. 用 MilliQ 水冲洗胶 2 次。
3. 用色谱纯甲醇和 MilliQ 水冲洗 Ep 管
4. 将枪头(200µ l)下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和
MilliQ 水冲洗枪头。
5. 对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入 Ep 管，MilliQ 水漂洗 2 次，如胶块 太大，将其切成 1 x 1 mm 的胶片。
6. 将切好的点做好标记和记录，置-80o C 保存或冻干后-20 oC 存放。
注意事项：
1. 尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的 PE 手套
（不用乳胶手套）和帽子。
2. 不要将胶长期存放于乙酸溶液中。
3. Ep 管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行 Western blottin g
的容器分开，以避免 casein 或 BSA 的污染。
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