猪肺炎支原体(Mhyo)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

猪肺炎支原体(Mhyo)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

96T

使用目的：

本试剂盒用于测定猪血清,血浆及相关液体样本中肺炎支原体(Mhyo)表达。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪肺炎支原体(Mhyo)表达。用纯化的猪肺炎支原体

(Mhyo)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中肺炎支原体(Mhyo)相结合，经洗涤除

去未结合的抗体和其他成分后再与HRP 标记的肺炎支原体(Mhyo)抗体结合，形成抗体-抗原

-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，

并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），与

CUTOFF 值相比较，从而判定标本中猪肺炎支原体(Mhyo)的存在与否。

试剂盒组成

1 30 倍浓缩洗涤液20ml×1 瓶7 终止液6ml×1 瓶

2 酶标试剂6ml×1 瓶8 阳性对照0.5ml×1 瓶

3 酶标包被板12 孔×8 条9 阴性对照0.5ml×1 瓶

4 样品稀释液6ml×1 瓶10 说明书1 份

5 显色剂A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 张

6 显色剂B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 个

标本要求

1. 血清：

室温血液自然凝固10-20 分钟后，离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保

存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

2. 血浆：

应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20 分钟后，离心20

分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。

3..尿液：

用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀

形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。

4.细胞培养上清：

检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。

5.培养细胞:

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100 万/ml 左右。

通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左

右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6.组织标本:

切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化

后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀

浆器将标本匀浆化。离心20 分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检

测，其余冷冻备用。

7．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上

进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

8．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

1. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2 孔、阳性对照2 孔、空白对照1

孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先

加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不

触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。

4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用

5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此

重复5 次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7. 温育：操作同3。

8. 洗涤：操作同5。

9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

10 分钟.

10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止

液后15 分钟以内进行。

计算和结果判定：

试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10

临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15

阴性判定：样品OD 值< 临界值（CUT OFF）者为肺炎支原体(Mhyo)阴性

阳性判定：样品OD 值≥ 临界值（CUT OFF）者为肺炎支原体(Mhyo)阳性

。

注意事项

1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。

2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未

用完，板条应装入密封袋中保存。

3．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物请避光保存。

6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm

7．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M 的硫酸，使用时必须

注意安全。

保存条件及有效期

1．试剂盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6 个月