什么是胎牛血清?胎牛血清(fetal calf serum ，简称FBS)是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛血清采自出生10至14天的小牛。胎牛血清的血清保存和使用须注意：血清应保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超过一个月。解冻血清时，应先将血清至于2-8℃冰箱，并经常摇匀使之溶解，然后至室温放置使之升温，绝对不可将冷冻的血清直接放入37℃水浴或者温箱中，如放在37℃解冻，颜色加深，粘稠度也会增加，血清在解冻和热灭活后，应按用量分装并于-20℃保存，避免反复冻融。胎牛血清(FBS)的作用：1、提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。2、提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。3、有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。4、是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。5、起酸碱度缓冲液作用。6、提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少;牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。

一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定)，经过一定的处理(如消化分散细胞、分离等)后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示)接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示)，此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期(数小时到数十天不等)，在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度—-196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。五、注意事项1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4、工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5、定期检测下列项目：5.1CO2钢瓶之CO2压力5.2CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水6、粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求不是太高，细胞娇弱，放置时间不宜过长。7、开紫外线照射台的时候，就将培养基、酶、DHANKS液那到室外让它自然升温。这样40分钟后，温度也升上来了。有很多人将他放到37度水浴锅里加热。一定要注意水浴锅的卫生，有的常年不清洗，里面很脏，容易在外面瓶身上吸附大量细菌。因此用它的也一定要勤换水。从水浴锅那出后，最好找个毛巾插干上面的水。

1、尽量用早期的细胞，传代太多状态不好，产毒也不好，贴壁困难。2、塑料的瓶子，Dmem+10%的小牛血清即可，要求并不高，ATCC上有详细的培养方法。3、主要是传代，胰酶消化点到即止，不能和其它成纤维细胞一样。最近的体会是：不用胰酶，轻轻吹打使细胞脱壁，然后将滴管前端插一个200ul的枪头，再吹打1min左右(有点费力)，肉眼看不见大的细胞团即可，此时显微镜下，可见细胞都分散开来，多数为单个，最多数个细胞，培养贴壁效果很好。因为枪头柔软，开口处小且规则，可以将细胞比较温柔地分开。

1.为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。2.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。3.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。4.制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗?是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl opti-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。5.我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%)，让血清给蛋白酶提供作用底物。6.如何检测内毒素(热源)水平?LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统)，通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。(通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)7.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗?如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。8. 20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗?对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.789. 室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少?缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。10. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少?生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。11. High Five细胞有任何其它名称吗?High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。12.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。13.High Five细胞用多大的密度冻存?

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