春暖花开，近期经济先行指数也露出笑容。　　就业、用电、原材料价格、大众商品价格都有所上升。　　以就业为例，据记者获得的资料显示，1-3月全国城镇新增就业320万人，比去年同期减少了20万人左右，不过这主要是在1-2月发生的。事实上到了3月，就业状况已经发生逆转，城镇新增就业较去年同期增加了80万人，同时全国就业情况总体趋稳。　　国务院发展研究中心经济运行监测系统负责人陈昌盛指出，跟踪了400多个村庄和就业市场发现，除了山西和东北局部地区外，总体上中国的就业形势比较好。　　国家统计局此前反映的调查失业率稳定在5.1%左右，没有出现相应的失业率波动大的问题。同时全国的经济增速尽管一季度只有7%，低于去年全年和一季度的7.4%，但是多个部委调查发现，全国没有出现大的就业问题。　　某部委参与调查的人士指出，各地目前招工难的情况有所缓解，一线工人的工资增速有所回落，未来就业需要继续观察，但是整体可控。另有部委人士也透露，从4月开始，全国用电情况开始好转，一季度负增长的情况出现了扭转。　　监测发现经济信息转好的不只是一个部门。　　中国物流与采购联合会副会长蔡进则指出，4月份上旬大宗商品价格平稳，4月下旬开始回升。主要呈现恢复性回升的势头。　　像国际油价每桶达到60美元左右的水平，开始有国际机构预测今年国际油价可能回升到每桶80美元的水平。价格回升是企业进行动力扩张的表现。　　蔡进所在机构实际调查也发现，近期制造业企业采购原材料数量有所增加，这反映出企业经营活动开始增加，下几个季度可能会继续推动经济平稳向好发展。　　“上半年经济保持7%以上是可能的，全年经济增速可能在7%左右。”蔡进在近期中国社科院2015年中国经济前景（春季）报告发布会上说。　　此前中国物流与采购联合会发布报告指出，3月生产经营活动恢复加快。3月份PMI指数回升到50.1%，主要受供给端生产活动回升所带动，同生产活动相关的指标普遍回升。生产指数再次恢复到52%以上，较上月上升0.7个百分点。　　3月企业采购活动趋于活跃，采购量指数、进口指数均有所上升。产成品库存指数回升明显，上升1.6个百分点，达到48.6%，显示前期库存已经明显消化，企业开始库存回补。据调查，3月多数企业正在积极安排生产活动，开启新的生产周期，谋划新年新开局。　　此前国家能源局数字显示，今年一季度全社会用电量增速为0.8%，但是3月为-2.2%，其中工业用电量3月增速为-4.1%。而电力部门也监测到了4月用电好转的信号。　　中电联根据最新报告指出断，下一阶段用电会继续回升。一季度全社会用电量同比增长0.8%，创2009年三季度以来的季度最低增速。但是后三季度，全国电力消费需求增速有望总体回升，预计全年全社会用电量增长3%-5%，其中上半年增长2%左右，好于一季度。

自2015年起，各类项目申请经费分为直接费用和间接费用两部分，《2015年度国家自然科学基金项目指南》所列资助强度为直接费用与间接费用之和。这一做法有何积极意义?和以往的项目申请有何区别?近日，国家自然科学基金委员会(下称基金委)发布了《关于2015年度国家自然科学基金项目申请与结题等有关事项的通告》(下称《通告》)，对于2015年的国家自然科学基金申请的相关事项进行了详细的介绍。《通告》中规定，自2015年起，各类项目申请经费分为直接费用和间接费用两部分，《2015年度国家自然科学基金项目指南》所列资助强度为直接费用与间接费用之和。申请人只需填报直接费用部分，间接费用及项目申请经费在申请书中自动生成。这一做法有何积极意义，和以往的项目申请有何区别?围绕这些问题，《中国科学报》记者采访了相关学者。间接费用直接生成据介绍，基金委2015年度项目申请集中接收工作自2015年3月2日开始，3月20日16时截止。2015年度集中接收申请的项目类型包括：面上项目、重点项目、重大项目、重大研究计划项目、青年科学基金项目、优秀青年科学基金项目、国家杰出青年科学基金项目、创新研究群体项目、地区科学基金项目、海外及港澳学者合作研究基金项目、联合基金项目、国家重大科研仪器研制项目(自由申请)、数学天元青年基金项目和重点国际(地区)合作研究项目等。不在集中接收申请范围的项目类型，其申请接收时间将另行公布。对于随时受理申请的国际(地区)合作交流项目，申请人应避开集中接收期提交申请。《通告》明确指出，自2015年起，各类项目申请经费分为直接费用和间接费用两部分。其中，直接费用包括设备费、材料费、测试化验加工费、燃料动力费、差旅费、会议费、国际合作与交流费、出版/文献/信息传播/知识产权事务费、劳务费、专家咨询费、其他支出;间接费用是指依托单位在组织实施项目过程中发生的无法在直接费用中列支的相关费用，主要包括依托单位为项目研究提供的现有仪器设备及房屋，水、电、气、暖消耗，有关管理费用的补助支出，以及绩效支出等。《指南》所列资助强度为直接费用与间接费用之和。申请人只需填报直接费用部分，间接费用及项目申请经费在申请书中自动生成。记者留意到，这应是基金委首次就直接费用、间接费用的问题在年度《通告》中作出明确说明。在2014年1月10日基金委发布的《关于2014年度国家自然科学基金项目申请与结题等有关事项的通告》中，就没有提及各类项目申请经费的构成问题。同样，2012年12月10日发布的《关于2013年度国家自然科学基金项目申请与结题等有关事项的通告》也没有涉及到这一问题。“这肯定是一个进步。2015年度的项目申请，基金委这边应该是把程序编到电脑里，再通过软件自动生成项目的间接经费。”中科院福建物质结构研究所研究员张健对记者表示。可增加缓冲空间目前，2015年度国家自然科学基金项目申请还未开始在线填写，间接经费的额度是多少、是否增加，仍然存在悬念。但多名学者表示，期盼基金委在间接经费方面更加灵活。中科院微生物所助理研究员李赛飞说，此前在相当长的一段时间内，原来的基金是没有绩效的，包括这个项目负责人的工资都是不可能从国家基金出的。现在基金委等部门在间接经费方面已经作出不少调整。她表示，间接经费对科研人员来说是一件大好事，“因为很多时候受使用规定的限制，有时在花经费的时候，因为有变化，不一定能够按照原来的规划来用。做科研的时候会遇到一些问题，出现和预期不一样的事情，这样有间接费用对于我们来说有缓冲的空间，是一件好事”。“现在经费使用都太严格了，我们希望更灵活、更人性化一点，这是我们的诉求。”李赛飞说。张健坦言，间接费用使用起来更灵活一点，包括绩效的部分。绩效支出，可以作为这个项目承担人员的奖励。以往国家基金项目的劳务费是支付给研究生或者临时工作人员的，但不能支付在编的工作人员，“但实际上这些国家基金项目，都是在编的人在承担、在负责，拿到基金又不能支付在编人员的工资，这明显是不合理的一块。这几年在间接费用里面有这个绩效支出后，相当于是对承担这些项目的在职工作人员的认可”。西安交通大学教授单智伟也认为，间接经费的额度可以更加灵活，“毕竟就做科研而言，不同的人所需经费也是不一样的。比如做实验科学的，他的花费要大很多，做理论计算的，相对来讲需要的硬件资源就比较少。应该具体问题具体分析更合理”。他认为，近年来，相关部门在间接费用使用方面的进步，相当于给了科研人员更多的自由度，这值得肯定。盼加大劳务费支出根据此前的 《财政部、科技部关于调整国家科技计划和公益性行业科研专项经费管理办法若干规定的通知》(财教〔2011〕434号)规定，课题经费的间接费用实行总额控制，按照不超过项目经费中直接费用扣除设备购置费后的一定比例核定(500万元及以下部分不超过20%)。间接费用中绩效支出不超过直接费用扣除设备购置费后的5%。对于这一规定，学者们也给出了一些建议。单智伟表示，实际上，对于自然科学的探索来讲，间接费用的分配是一件很难的事情。“因为自然科学基金的精髓所在就是帮助科学家在自然科学领域实现自由探索。既然是自由探索，就相当于我们在荒野里面找猎物，不可能事先设定我们要走哪条预定路线然后就一定能够发现猎物，我们只能是估算最佳路线，但往往需要在执行的过程中根据实际情况不断进行调整。因此，对一个猎人优秀程度的判据应该是他能打到多少猎物，而不是他是否严格按预定的路线进行了打猎。也就是说，我们更应该注重的是自然探索的结果，而不是过程。”张健表示，科研人员对于项目经费的期盼，实际上，还是希望“以人为本”，中国目前的制度体系还是“以物为本”，申请的基金都只能去买设备、药品等，而真正承担项目的人以前都从项目里拿不到绩效或者工资，现在总算有一些进步，因为间接费用可以支付单位的水电房租费，但建议还是希望加大劳务费的支出。单智伟认为，实际上，任何的基金制度，世界各国都一样要有一定的规矩，这是无可厚非的。长期以来，基金委也在不断作出调整，非常值得肯定。“改的时候，我们总希望更便利于科研人员作研究。”

青稞，在西藏语中称为Ne，在分类学上是一种裸大麦。和其他大麦不同，青稞经过藏族人民长达3500~4000年的驯化栽培，已经完全适应了极端的高原气候，成为了藏族人民的主食。据悉，西藏地区的青稞种植面积占西藏耕地面积的70%。现在，西藏是世界青稞的驯化和多样化品种栽培中心之一。为揭示青稞的高原适应性机制，解读其起源、驯化及栽培选育过程，西藏自治区农牧科学院，西藏自治区大麦和牦牛培育重点实验室，中国科学院，深圳华大基因研究院，华大科技等在内的众多研究单位，于2012年正式启动了青稞基因组研究合作项目。2015年1月13日，全球首个青稞基因组图谱正式绘制成功，其研究成果在线发表在PNAS杂志上，该研究对青稞的西藏地方品种Lasa Goumang 进行了全基因组测序及图谱绘制，获得了大小为3.89Gb的基因图谱，共包含36,151个蛋白编码基因。这是继小麦基因组(A,D)，大麦基因组物理图，国际小麦家族基因组研究工作的又一个里程碑式的进步，给未来麦类作物的改良以及其他高原作物的研究工作提供了宝贵的参考资料。研究采用全基因组鸟枪法测序，对西藏的地方品种青稞Lasa Goumang 进行了全方位解读。据估计，青稞基因组大小约为4.5Gb，本次研究所构建的青稞基因组图谱大小为3.89Gb，共占青稞基因组的87%，共包含36,151个蛋白编码基因。随后，研究人员将青稞基因组和其他的禾本科作物基因组进行了比对，结果发现青稞约于1700万年前从粗山羊草(小麦D)，乌拉尔图小麦(小麦A)以及冬小麦中分离出来。研究人员进一步分析发现，现代青稞基因组中仍然有大量的序列同粗山羊草(小麦D)，乌拉尔图小麦(小麦A)和短柄二叶草相似，其相似基因家庭数目高达18,849个。研究人员又进一步对青稞的高原适应性和人工选择情况进行了研究。通过对10株野生和栽培青稞品种的重测序，研究人员发现，野生青稞品种的SNP数目是栽培青稞的2倍，这说明人工选育过程给青稞品种带来了基因瓶颈。而对于人们最感兴趣的，青稞的高原适应性机制问题，研究人员也做了专门的研究，并发现了一系列在青稞品种中发生了正向选择的基因家族。如，调节转录过程的基因家族，激活转录因子的基因家庭，防御反应相关的基因家庭等都得到了大量的扩张，这些基因家族的扩张使得青稞在面对高原的恶劣环境时具有更大的调节弹性，从而具有更好的适应性。此外，研究人员还观察到，一些调节信号通路的关键基因，如参与植物荷尔蒙信号传导，基因复制和修复，植物病菌反应等，都在青稞中表现出了正向选择。这些基因改变使得青稞具有更好的高原适应性和压力调节机制。这些结果的发现对于解读高原作物的适应性机制意义重大，给未来青稞作物以及其他高原作物的培育提供了重要的参考资料，将有助于解决青藏高原以及其他高原地区人民的粮食问题，改善他们的生活条件。华大基因的项目负责人赵山岑表示，作为麦族的重要一员，青稞基因组的发表，不但帮助我们更好的理解大麦类作物的不同驯化途径，同时也使得我们能够结合大麦，小麦，以及其祖先品种一窥麦族的进化历史。而耐寒缺氧等极端环境的适应性问题更好的为我们进行高原类作物的改良指明了方向，有助于解决民生中的粮食问题。

最近，来自中国农科院作物科学研究所和澳大利亚阿德雷德大学的研究人员合作进行的一项研究，在大豆中确定了一个特异性基因，对于大豆作物改良具有很大的潜力。因此我们有望培育出更好适应土壤盐化的大豆品种。本项目首席研究员、阿德雷德大学副教授Matthew Gilliham说：“从种植面积和收获量的角度来说，大豆是世界第五大作物。但是许多经济作物对土壤盐化很敏感，这可能对作物产量造成重大损失。”“最糟糕的是，受盐渍影响的农业土地面积迅速增加，预计在未来的35年内会翻倍。发现提高作物耐盐性的基因，将是我们改善全球粮食安全的关键所在。”中国农科院作物科学研究所的邱丽娟(Lijuan Qiu)教授和关荣霞(Rongxia Guan)博士，对几百个大豆品种的遗传序列进行检测之后，确定了一个候选的耐盐基因。然后，阿德雷德大学Waite校区ARC植物生物能源卓越中心的研究人员，研究了这个基因的功能。邱教授说：“最初，我们通过比较两个商业品种发现了这个基因。我们非常惊讶和高兴地看到，在其他一些商业品种、老的驯化大豆品种甚至野生大豆中，这个基因也赋予作物耐盐性。“在无盐渍地区培育的大豆新品种中，这个基因似乎是缺失的。这使得许多新品种更易受目前世界各地快速增长的土壤盐渍的影响。”通过识别这个基因，现在我们可以将这些遗传标记用于育种计划，以确保未来将生长在易发生土壤盐渍地区的大豆品种可以保持耐盐性。副教授Gilliham说：“这个耐盐基因发挥作用的方式，与我们了解的其他耐盐基因不同。现在我们可以使用这一信息，在不同作物(如小麦和葡萄藤)中寻找相似的基因，以选择性地培育高耐盐性的作物品种。”本研究得到了澳大利亚研究理事会(ARC)的资助支持，相关研究结果以专题文章的形式发表在最近的《Theplant JouRNAl》杂志。

实验方法硫酸铵沉淀法实验方法原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 实验材料 动物血清样品试剂、试剂盒 硫酸铵NH4OHPB液BaCl2溶液纳氏液洗脱液生理盐水仪器、耗材 透析袋离心机烧杯搅拌棒抗体 CD2抗体山羊Lambda Light Chain多克隆抗体山羊Complement C4多克隆抗体实验步骤 一、材料与试剂配制  1.  动物血清 2.  硫酸铵饱和溶液 硫酸铵：800 g~850 g H2O ：1 000 ml 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温，然后以28% NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置后滤过，加热蒸发H2S即可。 3.  0.01 mol/L pH7.4 PB液 A液：0.10 mol/L NaH2PO4液 NaH2PO4·2H2O ：15.60 g 加H2O至1 000 ml B液：0.10Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO4·12H2O： 35.80 g 加H2O至1 000 ml 取A液19 ml，B液81 ml加水至1 000 ml即可。 4.  1%BaCl2溶液 5.  纳氏液 HgI ：115.00 g KI： 80.00g 加H2O至500.00 ml 溶化后过滤，然后再加20%NaOH 500.00 ml，混合即可。 6、0.50 mol/L的HCl液和0.50 mol/L的NaOH液 7、洗脱液 0.03 mol/L的NaCl液。 8、透析袋（或玻璃纸） 二、操作方法  1.  取20 ml血清，加生理盐水20 ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10 ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30 min。 2.  3 000 r/min离心20 min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。 3.  在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30 ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30 min。 4.  3 000 r/min离心20 min，弃上清。 5.  于沉淀中加20 ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10 ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30 min。 6.  3 000 r/min离心20 min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。 7.  用10 ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。 8.  透析除盐，在常水中透析，再在生理盐水中于4℃透析24 h，中间换液数次。 以1%BaCl2检查透析液中的SO4 2-或以纳氏试剂检查NH4 （取3~4 ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4 存在），直至无SO4 2-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。 9.  离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白）。 10.  过DEAE－纤维素层析柱。以0.01 mol/L pH7.4 PBS（0.03 mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。 11.  蛋白质及其定量鉴定。 12.  IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。 （1）区带电泳 玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。 （2）琼脂双相双扩散鉴定 预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。 （3）免疫电泳鉴定 孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。 （4）圆盘电泳鉴定 用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。 13.  IgG的浓缩与保存 （1）IgG的浓缩 （2）IgG的保存 一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01%硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。

1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。8．如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最终PEG浓度为12％。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。9．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。 作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。10．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。11．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。 保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

日，一则北京中医药大学在美国《科学》杂志“花钱买版”做宣传的消息引发广泛关注。昨天，北中医校长徐安龙和《科学》杂志国际协作、运营与出版副总监吴若蕾回应北京青年报记者称，北中医确实出资赞助了一份《科学》杂志中有关传统医学的专刊，专刊刊有徐安龙文章一篇，但徐本人文章的发表与是否赞助无关。北青报记者证实，该篇文章确实未经杂志编委会评估，但经过“同行评审”。缘起北中医校长在《科学》杂志发论文被指“花钱买版”近日，一则“美国《科学》杂志专门为中医出专刊”的消息引发热议，不少人认为这是国际顶尖学术界对中医的认可，但也有声音质疑，所谓专刊只是由赞助商花钱出版的广告宣传小册子而已，与专业的学术论文毫无关系。根据《科学》杂志官方页面显示，该专刊的主题是传统医学，本期中医药专题是由北京中医药大学与香港浸会大学共同赞助发行的第一期，后续还会有关于世界各地传统医药的介绍。而此系列被明确标注为定制出版办公室（CUSTOM PUBLISHING OFFICE）受赞助发行的增刊（SUPPLEMENT），内文首尾都有特别声明，称这些经赞助编辑出版的特殊内容并非经过同行评议，也没有经过《科学》编辑部的审核。为此，北青报记者向北京中医药大学和《科学》编辑部进行了求证。调查校长论文发在《科学》杂志什么位置？非广告也非正刊北青报记者注意到，这份介绍传统医药的专刊刊登在12月19日的《科学》杂志正刊之中，页码标注为S1-S25，除了徐安龙的文章，还有其他作者的7篇文章同时发表。昨天，徐安龙在接受北青报记者采访时表示，“这篇文章是发表在《科学》杂志S13页的，与‘买广告’完全是两回事。广告页是没有页码的。”此份专刊的编委之一、剑桥大学药理系教授樊台平向北青报记者证实，徐安龙此文是樊台平为这份传统医药专刊而向其约稿，页码标注的“S”代表的是“special issue”，也就是专刊。北中医是否在《科学》杂志“花钱买版”？学校给《科学》杂志一定赞助费因为北京中医药大学赞助这份专刊，专刊内又同时刊有北中医校长徐安龙的文章，徐被质疑“花钱在国际期刊上出版自己文章”。对于外界传言的“花钱买版”一说，据《科学》杂志国际协作、运营与出版副总监吴若蕾介绍，国际国内所有学术期刊的正刊几乎都会向作者收取版面费，但《科学》杂志作为非营利机构，则不向作者收取版面费，只有在文章有彩图时，会依据印刷厂要求而收取彩图费。专刊本身不向作者收费，《科学》会邀请业内顶尖机构进行赞助，也会有机构主动要求提供赞助。据北京中医药大学校方解释，对于这份引起争议的传统医学专刊，他们确实接到了美国《科学》杂志的赞助邀请。作为国内中医界的顶尖机构，最终学校决定接受邀请，并提供了一定金额的赞助。“这事儿我其实一开始也拿捏不准，心里一直也很矛盾，但后来通过校长办公会集体决定，一致认为这是一件好事，作为教育部唯一直属的中医类高校，我们认为应该承担起给中医药在国际最好的学术刊物里提供一个学术舞台的责任。”徐安龙表示。文章是否具有权威性？未经杂志编委会评估 但邀请了同行评审北青报记者注意到，在这份专刊的S1页以及所刊载包括徐安龙文章在内的8篇学术文章首页，均标注“这些内容没有得到期刊编委的评估”，这让众多业内人士质疑此专刊和徐文章的权威性。对此，徐安龙表示，由于《科学》杂志内部目前还没有专业针对中医领域的专家，无法自行组织评审，因此委托了中医领域专家组成临时专家委员会，对该文章进行了“同行评审”。据徐安龙介绍，这篇名为《“症”——疾病诊疗的系统生物学方法》的文章，是源于他今年年初在南京参加中医药领域的学术会议时发表的学术研究成果，得到了与会专家的高度关注，同时也吸引了《科学》杂志的注意。按照《科学》杂志的编审流程，编辑确定该文章符合发表要求后，会在团队内部安排一位这一领域专家来负责组成专家评审团进行“同行评审”，并根据专家评审团意见向编辑提供是否发表的意见。但是，《科学》杂志内部目前还没有中医领域专家，因此委托了来自剑桥大学药理系的樊台平教授担任核心专家的角色。樊台平告诉北青报记者，此次“同行评审”团由六位专家组成，为了保证评审团队的公正性，还特意选择了两位外国专家来一同进行评判。“事实上我们经过了严格的‘同行评审’流程，按照专家的意见，我对这篇文章反复修改了五稿，包括标题也进行了两次修改。”徐安龙表示，“不是每一个投稿的文章都能刊登，选择了我是因为我正好讲的是传统中医与现代科技整合的主题。也不是每一期都写中医，后面的合作可能会聚焦于其他国家的传统医学。”吴若蕾告诉北青报记者，这类没有办法做同行评议的文章，是以副刊的形式随正刊一起发行，还是以专刊的形式放在正刊内，可以由编辑团队或者作者自己选择。这份专刊他们选择放在了正刊内，但确实是没有经过《科学》杂志的评议，所以要作出特别标注，以区别于正刊中其他经过评议的论文。对话“赞助与发表文章无关”对话人：吴若蕾 美国《科学》杂志国际协作、运营与出版副总监北青报：有说法认为这本介绍中医药的专刊只是《科学》的一本广告宣传小册子，或者称为“商业增刊”，是《科学》广告部为客户提供的商业定制，发表客户的专属内容。吴若蕾：首先，《科学》没有所谓的广告部，也没有“商业增刊”这个说法。除了正刊，我们还有定制出版物，包括专刊、副刊、海报、已发论文的集锦，还有网络论坛等。这本确实是介绍传统医学专刊，而且是刊登在12月19日《科学》杂志正刊内的，更不是广告。这本专刊是我们组织了一个专门的编辑团队历时三年编辑而成。没有哪个广告会用三年的时间来编辑完成吧。北青报：既然是正刊的一部分，为什么会放在《科学》杂志网站的“BOOKLET”（小册子）分类下面提供给读者免费阅读和下载？吴若蕾：学术杂志有两种获取方式，付费订阅或者是在网上开放获取（open access），免费提供给读者。《科学》的正刊要付费，专刊部分是可以免费阅读的，以便最大限度地扩大影响。我们把专刊、副刊还有其他可以免费阅读的内容都放在了这个分类下面，但这份专刊并不是小册子，在网上看不出来，看到纸质版的杂志就知道它与小册子是完全不一样的东西。北青报：这份专刊是受北京中医药大学和香港浸会大学商业赞助发行的吗？吴若蕾：这份传统医学的专刊将分三期刊载，赞助方很多，除了12月19日这一期封面写明的北京中医药大学和香港浸会大学，还有澳门科技大学、中国中医科学院等，这些赞助商在以后两期的专刊封面会有所体现。《科学》是非营利机构，本身没有这么多预算，需要赞助方来承担印刷和发行的费用，这个赞助方可能是主动来找我们的，也有可能是我们自己找的。不过，对于赞助方，我们也有标准，须是相关领域的顶尖或者权威，不是给钱就能行的，这属于公益赞助，不是利益交换，更不是所谓的“商业赞助”。北青报：正是专刊封面写明由北京中医药大学和香港浸会大学赞助，内页又刊有北中医校长的文章，因此有质疑说是北中医“花钱买版”给自己做宣传。吴若蕾：北京中医药大学确实有付赞助费用，中医药大学和浸会大学赞助的是这份专刊的出版和发行，不是为了发自己的文章而花钱买版面，目的是为了在国际推广中医药。这份专刊里面徐安龙校长的文章也只有一篇，他的文章能否发表与是否赞助没有关系。北青报：那什么样的文章能发在专刊？吴若蕾：不方便发论文或者不以论文形式为载体的内容就可以用专刊或者副刊的形式体现。或者看作者自己的需求，有些就更愿意以专刊或者副刊的形式发表。这些在专刊上的文章不能用评判论文发表的形式来评判，更类似科技推广、宣传。北青报：与正刊内的论文相比，专刊文章的权威性是否会减弱？吴若蕾：没有谁的权威性更高一说，也不是只有论文才是科学，科学也包括科技推广、科普宣传等内容。例如中医药，我们之所以在专刊标注未经过同行评议，是因为国际上没有这方面的专家来对论文进行同行评议，西方国家也没有这个学科，但不说明文章没有科学价值。

化学反应共振态研究获突破本报讯（记者刘万生 通讯员关佳宁）1月4日，记者从中科院大连化物所获悉，该所分子反应动力学国家重点实验室杨学明院士、张东辉研究员领导团队，在分子反应动力学研究工作上再获进展，极大提高了人们对化学反应共振态的认识。相关论文发表于1月2日出版的《科学》杂志。据介绍，化学反应动力学研究的一个根本任务，是认识反应过渡态如何控制化学反应速率和产物分布，直接观察反应过渡态长期以来一直被认为是化学研究中的一个“圣杯”。但由于反应过渡态寿命非常短（飞秒数量级，1飞秒等于10-15秒），实验上直接观测这些短寿命化学反应过渡态极其困难。而反应共振态是化学反应体系在过渡态区域形成的具有一定寿命的准束缚态，它提供了一个让实验直接观察化学反应在过渡态附近行为的契机，因而几十年来，寻找反应共振态一直是备受关注的重要课题。研究人员对相关反应进行高分辨交叉分子束研究，发现一定的前向散射信号，并在后向散射信号随碰撞能的变化曲线上存在振荡现象。为解释实验发现，张东辉等人利用他们提出的势能面多级构造法，构造了该体系目前最为精确的势能面。在新的势能面上，理论与实验取得了高度吻合。进一步分析表明，此类化学键“软化”现象是由于反应过渡态附近的非谐性所导致的，而几乎所有的化学反应的过渡态附近都存在非常大的非谐性，因而往往能在振动激发态绝热势能面上造成一定的势阱，并有可能支持共振态。这一研究揭示了物理化学家长期寻找的化学反应共振态的“新机理”—— s化学键软化。这项研究为化学反应共振态研究指明了新方向。研究人员首次制备出帕金森病(Parkinson’s disease)猕猴模型本报讯 帕金森病(Parkinson’s disease)是仅次于老年痴呆的世界第二大神经退行性疾病，对中老年人的健康造成严重威胁。中国科学院遗传与发育生物学研究所李晓江及其合作者获得了6只转基因帕金森病(Parkinson’s disease)猕猴。这是国际上首次制备成功帕金森病(Parkinson’s disease)的转基因猴模型，为帕金森病(Parkinson’s disease)的早期发病机理研究及早期干预治疗提供了重要动物模型(Animal Models)。该研究结果于2014年12月31日在线发表在《人类分子遗传学》。据介绍，帕金森病(Parkinson’s disease)的发现、确诊往往是在病程的中后期，以致治疗效果不理想。但由于研究帕金森病(Parkinson’s disease)的早期病理机制过程中缺少理想的动物模型(Animal Models)，目前对于该病的早期发病机理和针对性治疗知之甚少。猕猴与人类在神经生理结构及行为学方面具有高度相似性，是研究神经疾病的理想实验动物。李晓江等人曾在美国Emory大学于2008年用转基因方法建立了首例神经退行性疾病（享廷顿病）猕猴模型。采用相类似的转基因方法，李晓江研究组与云南中科灵长类生物医学重点实验室研究员季维智实验室合作，通过4年努力获得了6只转基因帕金森病(Parkinson’s disease)猕猴。现年龄最大的转基因帕金森病(Parkinson’s disease)猴在2.5岁开始表现出认知记忆和精细动作障碍以及焦虑抑郁症状，这些特征与帕金森病(Parkinson’s disease)人出现运动障碍之前的早期临床表现非常吻合。该研究得到了科技部“973”项目、国家自然科学基金以及分子发育生物学国家重点实验室经费的资助。（柯讯）流感继发细菌性肺炎研究获进展本报讯 流感是历史上造成人类死亡最多的疾病之一，而其中约90%的死亡病例的死因是继发细菌性肺炎。中科院微生物研究所王北难课题组日前在美国《国家科学院院刊》发表最新研究结果，揭示了病毒和细菌与宿主在致病机制中的相互关系，以及流感病毒与细菌性肺炎相关的分子机制(Molecular Mechanisms)，为预防细菌性肺炎和控制流感死亡率提供了不同的角度和新药物靶点。据介绍，虽然流感病毒继发的肺部细菌感染现象被人们广泛关注，但其分子机制(Molecular Mechanisms)仍不清楚。为了控制流感暴发引起细菌性肺炎而造成的死亡，了解其机制是重要前提。王北难课题组发现，流感病毒的神经氨酸酶（NA）可以活化宿主体内的转化生长因子-β（TGF-β），导致宿主细胞表面的黏附分子表达增高。此类黏附分子（例如纤连蛋白和整合素）与细菌黏附宿主细胞表面相关，会使细菌对宿主肺细胞的黏附增加，从而引起继发的细菌感染，而抑制病毒NA的活性或TGF-β信号传导通路就能有效地阻断流感病毒感染后细菌对肺组织的黏附。该研究小组还证明，流感病毒介导的细菌黏附由细菌表面的纤维蛋白结合蛋白引起，因此拥有该类毒力蛋白的细菌与流感继发的细菌感染密切相关，例如肺炎球菌、金黄色葡萄球菌、A型链球球菌和流感嗜血杆菌。（张章）

上海彩佑教你Elisa实验样本的准备，在收集样本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测的样本，及时储存在4℃备用。对于隔天再检测的样本，及时分装后冻存在-20℃备用，有条件的，最好-70℃冻存备用。标本应避免反复冻融。    液体类标本:  包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。3. 尿液：用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。5. 培养细胞    检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。6. 组织标本    切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

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一、gst pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过sds-page电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase) 二、足印法(Footprinting)足印法(Footprinting)是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase(脱氧核糖核酸酶)分解，在对目的DNA序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。 三、染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，chip)染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别 反应，将与目的蛋白相结合的dna片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。 四、基因芯片(又称 DNA 芯片、生物芯片)技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。通俗地说，就是通过微加工技术 ，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于2cm2 的硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，被称为基因芯片。基因芯片主要用于基因检测工作 。基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。 五、高效液相色谱(HPLC)高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。 六、酵母双杂交(Y2H) 七、噬菌体展示技术噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合特性的目标噬菌体。 八、RNA提取(Trizol法)Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA，有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。九、RT-PCRRT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。实验步骤：1、RNA的提取;2、反转录合成cDNA;3、PCR扩增;4、产物的电泳和结果的测定。 十、实时荧光定量PCR(Q—PCR)(Real-time Quantitative PCR )利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期。C(t)值：荧光信号(扩增产物)到达阈值时所经过的扩增循环次数。 十一、BCA法测蛋白质浓度 十二、大肠杆菌感受态细胞(E.coli DH5α)制备1、前夜接种受体菌(DH5?或DH10B)，挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜(约16小时);2、取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时(250-300rpm);3、将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷;以下步骤需在超净工作台和冰上操作;4、吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟;5、4℃下3000 g冷冻离心5分钟;6、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟;7 、4℃下3000 g冷冻离心5分钟;8 、弃去上清，加入100微升预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮;9 、细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后超低温冷冻贮存备用(-70℃)。 十三、碱变性提取质粒DNA碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 十四、目的基因的连接、转化及克隆筛选(1)总过程：分---PCR分离目的基因切---限制性内切酶切割接---目的基因与载体相连转---转入宿主细胞筛---筛选阳性重组体(2)分---PCR分离目的基因：PCR克隆、同源克隆、文库筛选(3)切---限制性内切酶切割：粘性末端、平末端(4)接---目的基因与载体相连原 理：利用DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个或者几个A碱基的特性和利用T载体3’末端的T碱基和PCR产物的A碱基互补配对,经连接酶作用,完成与载体的连接。(5)转---转入宿主细胞感受态细胞：经过电击、 CaCl2、 RuCl等化学试剂处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。(6)筛---筛选阳性重组体 十五、RNA干扰(RNAi)一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(RNAi)。 十六、cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术cDNA 末端快速扩增 (rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术是一种基于mRNA反转录和 PCR技术建立起来的、以部分的已知区域序列为起点,扩增基因转录本的未知区域,从而获得mRNA(cDNA)完整序列的方法。简单的说就是一种从低丰度转录本中快速增长cDNA5’和cDNA3’末端，进而获得获得全长cDNA简单而有效的方法，该方法具有快捷、方便、高效等优点,可同时获得多个转录本。因此近年来RACE技术已逐渐取代了经典的cDNA文库筛选技术,成为克隆全长cDNA序列的常用手段。 十七、基因文库和cDNA文库的构建(看课本上的) 十八、mRNA差异显示技术(DD-PCR)mRNA差异显示技术是将mRN A逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。每一种细胞(包括同一组织细胞经过不同的处理)都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱(有差异基因表达)，即特异的RNA指纹图谱。差异基因表达是细胞分化的基础，正是这些基因在细胞中的特异表达与否，决定了生命历程中细胞的发育和分化、细胞周期调节、细胞衰老和凋亡等。mRNA DDR T-PCR 技术正是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。 其基本原理是从基因背景相同的2个或几个被比较的细胞系或组织中提取总RNA，逆转录成cDNA ，用不同引物对，进行PCR 扩增，扩增时加入同位素标记的核苷酸。利用测序胶电泳技术分离PCR 产物，经放射自显影即可找到差异表达的基因。 十九、抑制差减杂交抑制差减杂交技术原理抑制差减杂交技术(SSH)是由Diatchenko等建立的以抑制性PCR和DNA差减杂交方法相结合的方法。其依据的主要技术有两点:(1)消减杂交;(2)抑制PCR。经抑制差减杂交后的cDNA群体不仅富集了差异表达基因(目的基因),而且目的基因间丰度的差异经过均等化作用已基本消除,使消减后的cDNA群体为丰度一致的目的基因群体。抽提两种不同来源组织的mRNA(tester和driver),反转录成 cDNA,用4碱基识别酶(RsaI)或HaeIII酶切两种cDNA产生平端片段;将testerc DNA分成均等的两份,分别接上dapter1和adapter2两种接头,并与过量的经RsaI消化的driver样本变性后退火杂交。第一次杂交后有4种产物:a是单链testercDNA;b是自身退火的testercDNA双链;c是tester和driver的异源双链;d是drivercDNA。根据复性动力学原理,丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA,因此第一次杂交使得丰度有差别的cDNA的单链分子的相对含量趋向一致。混合两份杂交样品,同时加入新的变性driver cDNA 进行第二次消减杂交。杂交完全后补平末端,加入合适引物(即adapter1和adapter2的部分特异序列)进行PCR扩增,只有含不同接头的双链DNA分子(e)才可进行指数扩增,扩增产物即为目的片段。利用adapter上的酶切位点可进行克隆、测序等。 二十、蛋白质芯片 二十一、Northern blot 二十二、Southern blot 二十三、荧光共振能量转移  二十四、双分子荧光技术 二十五、酶联免疫吸附测定(ELISA)ELISA是一种免疫测定(immunoassay，IA) 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 二十六、双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。 二十七、mRNA的分离与纯化(寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA)真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构(m7G)和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚(dT)-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly(A+)的特点，在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚(dT)纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 二十八、His-tag纯化蛋白His?Tag序列(6、8或10个连续的组氨酸残基)与固定在基于NTA(氮川三乙酸镍) -和IDA- 的His?Bind树脂上的二价阳离子Ni2+结合。洗去未结合蛋白后，用咪唑或稍低的pH洗脱并回收目标蛋白。该通用系统使得可在温和、非变性条件，或存在6M胍或尿素条件下纯化蛋白。 二十九、RNA酶保护试验方法 (RNase Protection Assay，RPA)RNA酶保护法是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA;未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护实验。与Northern blot和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3.由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4.步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。 三十、免疫组化 三十一、各种分子标记技术的比较限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。随机扩增多态DNA (Randomamplified polymorphic DNA ,RAPD) 技术,由于其独特的检测DNA 多态性的方式使得RAPD 技术很快渗透于基因研究的各个领域。RAPD 是建立于PCR 基础之上的分子标记技术,基本原理是利用一个随机引物(8～10 个碱基) 通过PCR 反应非定点地扩增DNA 片段,然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA 多态性研究。对任一特定引物而言,它在基因组DNA 序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。扩增片段长度多态技术(AFLP) ,又名限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplifi2cation ,SRFA) ,于1993 年由荷兰KEYGENE 公司的Zabean 和Vos 等发明。AFLP 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术,它将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后产生的片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来,并通过5′端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段,从而形成指纹图谱的分子标记技术。AFLP 指纹呈孟德尔式共显性和显隐性遗传。SSR 也称微卫星DNA ,是一类由几个(多为2～6个) 碱基组成的基序串联重复而成的DNA 序列,其中最常见的是双核苷酸重复,即(CA) n和(TG) n ,每个微卫星DNA 的核心序列结构相同,重复单位数目10～60 个,其高度多态性主要来源于串联数目的不同。不同遗传材料重复次数不同,导致了SSR 长度的高度变异性,这一变异性正是SSR 标记产生的基础。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism ,SNP) 被称为第3 代DNA 分子标记,是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异,这种差异包括单个碱基的缺失或插入 ,更常见的是单个核苷酸的替换,且常发生在嘌呤碱基(A 与G) 和嘧啶碱基(C 与T) 之间。SNP 标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异,被认为是应用前景最好的遗传标记。 

2014年11月30日，国际学术期刊《分子与细胞蛋白质组学》molecular & Cellular Proteomics在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所系统生物学重点实验室曾嵘研究组与美国范德堡大学定量科学中心石瑜研究组的最新合作研究成果，揭示了稳定同位素化学标记高精度质谱数据中高丰度、高频率噪音离子的去除可以显著提高蛋白质鉴定率。在定量蛋白质组学研究中，稳定同位素标签结合高精度质谱仪可以在一次实验中对多个样品进行相对定量比较，这种策略比非标记定量具有更高的精确性。另一方面，体外化学标记相对于体内标记方法如SILAC，具有更高的样品通量和普适性，使得体外化学标记在定量蛋白质组学研究中得到了广泛的应用。对于该策略得到的肽段二级质谱谱图，其中的报告离子用于定量，而其他离子则用于鉴定该肽段。但报告离子以及其伴生离子并未包含多肽序列信息，这些离子会降低数据库搜索鉴定的敏感性和准确性。由于定量是建立在数据库鉴定的基础之上，在数据库搜索前对质谱数据的预处理就尤为重要。在曾嵘研究员和石瑜教授的共同指导下，盛泉虎，李荣霞和戴捷等人对稳定同位素化学标记数据首先进行了高丰度、高频率离子的分析，然后进行了16种不同组合的数据预处理，最后用5种不同搜索引擎进行了数据库搜索分析。研究表明，在高精度质谱数据中，存在大量稳定同位素标签相关的高丰度、高精度离子。结合各种预处理方法，判别和去除这些离子可以提高四标数据16.3%的鉴定谱图，13.9%的鉴定肽段以及6.6%的双肽段鉴定蛋白质。对于八标复杂数据，预处理方法则可提高50.2%的鉴定谱图，39.5%的鉴定肽段以及25.2%的双肽段鉴定蛋白质。这表明，标记通道的增加，在提高样品通量的同时，也引入了更多的伴生离子，判别和去除这些离子可以更显著提高鉴定的敏感性。基于组学大数据和系统生物学平台，曾嵘研究组通过多年努力自主开发了一系列蛋白质组数据分析技术，该工作建立的方法与此前的Buildsummary，ProteomicsTools, SRMBuilder 等工具一起 (Sheng et al., J Proteome Res 2012; Su et al., JMCB, 2014)，形成了更加完善的蛋白质组学工作流程。该研究工作得到了国家科技部和国家自然科学基金资助。示意图：预处理可以显著提高谱图、肽段和可靠蛋白质的鉴定率

中国日报网1月2日电（信莲） 据英国《每日邮报》1月2日报道，英国顶尖医学专家理查德?史密斯日前发表专栏文章，呼吁社会各界不要再浪费金钱以试图治愈癌症，因为患癌症而病逝是“最好的死法”。史密斯现年62岁，他曾在世界著名的综合性医学期刊《英国医学杂志》担任过13年的编辑，如今是一家医疗科技公司的负责人。最近，他撰写的一篇有关死亡本质的博客引发关注和争议。在文章中，史密斯写道除了自杀之外，死亡的方式可以分为四大类：猝死、痴呆症导致的或长或短的死亡、器官衰竭致死以及患癌病逝。“很多人告诉我，他们更倾向于猝死，但我认为这种死亡方式对于死者家属而言太难接受。在我看来，患痴呆症后或长或短的死亡过程是最糟糕的，因为那时你的记忆被慢慢抹掉，然后似乎突然之间死神就降临了。而器官衰竭致死是一个漫长的过程，并且这段时间内病人需要长期就医、生活质量急剧下降。”康成生物首推环状RNA芯片服务 由此，史密斯得出结论称：“患癌而死是最好的死法。因为你会有时间向亲友道别、反思过往、留下遗言、甚至重新回到某些特别的地方追忆过去，你还能听喜欢的音乐、读美妙的诗篇、向你的上帝祷告……我承认，这种死亡的方式听上去太过浪漫，但却是可以实现的。所以，让我们远离那些野心太大的肿瘤学家、停止浪费金钱治愈癌症吧！”不出意外地，史密斯的这番言论招致同行的猛烈抨击，也在社交媒体引发热议。有网友表示尽管听上去“离经叛道”，但他能够理解史密斯的看法，“我的父亲死于癌症，看到他慢慢死去我们很难受，可我们也很庆幸有机会向他说‘再见’”。不过也有人斥责史密斯根本称不上“医生”，“他显然没有去过癌症病房，没有亲眼见过癌症病人有多么痛苦”。（原标题：英国医学家语出惊人：患癌而死是最好的死法）

在刚刚过去的2014年里，美国科学家Eric Betzig、William Moerner 和德国科学家Stefan Hell，因为对超高分辨率显微镜所做出的贡献，获得了诺贝尔化学奖。这一技术的意义在于突破了几个世纪以来光学显微镜的“衍射极限”。这些科学家们从不同途径“突破”了这一极限，使人们能够分辨相距少于200nm的两个物体。生物通报道：在刚刚过去的2014年里，美国科学家Eric Betzig、William Moerner 和德国科学家Stefan Hell，因为对超高分辨率显微镜所做出的贡献，获得了诺贝尔化学奖。这一技术的意义在于突破了几个世纪以来光学显微镜的“衍射极限”。这些科学家们从不同途径“突破”了这一极限，使人们能够分辨相距少于200nm的两个物体。这类技术被统称为超高分辨率显微技术或纳米显微技术。目前主要的超高分辨率技术包括：光激活定位显微技术PALM、随机光学重建显微技术STORM、受激发射损耗STED，结构照明显微技术SIM和RESOLFT。其中，PALM和STORM属于单分子定位显微技术。专家们认为与荧光显微技术不同，电子显微镜（EM）能获得精确的结构信息，但是通过EM识别特殊蛋白是一个费力不讨好的工作，而且一般也不能定量。而通过衍射极限荧光成像的电子显微技术虽然获得的信息量大，但是无法达到几十纳米级别的分辨率。超分辨率荧光成像技术现在已接近电子显微镜技术，不过这两者之间还是存在至少一个数量级的分辨率差异。如果能将这两者结合，提炼电子显微和超分辨率荧光显微的优点，也许能带给我们惊喜。把这两种方法放在一起并不是件简单的事。首先样品准备需要能用于两种不同的方法，以最小的失真完成高质量成像。其次以两种模式获得的成像也必须能精确对齐，这样才能真正提供补充信息。比如说来自美国NIH的一组研究人员为了将电镜EM与光激活定位显微技术PALM结合在一起，对细胞表面结构成果，研发出了一种样品准备的方法，这种方法基于嵌入式金纳米棒，能完成20 纳米分辨率的相关成像（Correlative super-resolution fluorescence and metal-replica transmission electron microscopy）。此外这种关联技术还需要EM样品准备中合适的荧光标记，另外一篇文章中，来自加州理工学院的研究人员为了关联细菌细胞的PALM与冷冻电子层析成像，找到了能在冷冻条件下进行光开启的荧光蛋白，而且他们也成功阻止了冰晶体的形成。（Correlated cryogenic photoactivated localization microscopy and cryo-electron tomography）生物通 www.ebiotrade.com 免费索取默克密理博Stericup & Steritop 无菌过滤装置资料，实现高流量、高通量、高特异性蛋白质吸附这就是关联光学和电子显微镜技术（Correlative Light and Electron Microscopy，CLEM），这种技术既有荧光显微镜FM的分子标记功能，又具有电子显微镜EM捕获超微结构细节的高分辨率。这一相关显微镜技术让细胞生物学家有可能理解生命大分子在细胞里的动态，得到其亚细胞结构的更多信息。而这些相应的解决方法也将能帮助这种超分辨率技术快速发展，用于生物学研究。您可能感兴趣的生物通精选文章：·2014年最受欢迎的显微镜技术论文(12-17)·Nature子刊介绍新原子力显微技术(01-21)·新型显微技术成功用于生物成像(02-20)·Nature年度技术之超高分辨率显微技术(12-27)·Nat Methods专题：高分辨率显微技术(12-03)原文摘要：Super-resolution CLEMCorrelated light and electron microscopy (CLEM) is particularly powerful when applied in super-resolution. 全基因组芯片技术突破基础研究和医学难题 PALL鼓励中国科研工作者SCI文章发表活动 30000奖金等着您基因科技文献奖励活动火热进行中！在SCI收录期刊上发表文献采用了相关试剂盒，均有机会活动高达上千元的奖励！

谱写风雨同行 铸就共创辉煌                    - 时光飞逝，岁月如梭，转眼间忙碌的2014年已过去，充满期待的2015年向我们走来。勤劳智慧的雅吉生物全体员工在2014年1月18号这一天欢聚一堂，一起总结过去一年的成就与不足，展望未来一年的方向和目标。  此次年会公司荣幸的邀请到广西大学廖老师莅临。与我们共同分享各个精彩瞬间。 年会开始让公司一个小游戏拉开序幕，先让大家都能在互动的游戏中享受到轻松活跃的氛围，并感受年会的轻松愉快。紧接着在游戏结束之后由公司杨总发表感言主要评介2014年公司取得不俗的成绩，我们雅吉生物从成立到现在，现已成为上海生物行业中发展前景看好的佼佼者。这是全体员工共同努力的结果。讲话中还特别表扬了公司优秀员工在2011年的优异表现，并希望在全体员工在新的一年里大家都能再接再厉，在工作岗位上不断创新，不断进步，在新的一年里能再创佳绩。  公司对优秀的员工设立了奖项，分别有年度最佳贡献奖1名，奖金6000元；最佳工作作风奖1名，奖金3000元；优秀服务奖1名，奖金1500元；最佳新人奖2名，奖金1000元。奖状由我们的特别嘉宾廖老师颁发，拿到奖励的员工们都非常高兴，并当场表示在新的一年里会再接再厉，工作上会不断创新，不断进步，在新的一年里能再创佳绩。  在发完奖金之后，我们还进行了抽奖，设立了特别幸运奖、安慰奖、三等奖、二等奖、一等奖、特等奖，分别有棉被、微软鼠键、品牌电动锅、音箱、金士顿8G的U盘。杨总、莫总、胡老师、余老师等领导与员工真情互动、激动人心的抽奖活动，让掌声、欢呼声久久地荡漾在晚会现场。  团年饭安排在金湖广场旁边的小肥羊火锅店，在整场团年饭中欢笑声和掌声不断，大家乐其融融。  此次团夜饭还特别安排公司所有员工去唱K，为员工提供一个展示自我的舞台，使员工不断挖掘自身表演才能，丰富文化生活。整场团年饭在和谐、温馨、欢乐的氛围中圆满结束。  好水带财，伴着这新春雨水的祝福，相信熙软科技公司将会在杨总、莫总、黄老师等人的英明带领下铸就新的辉煌，产量一路飘红，再创新高。

大鼠Ⅰ型前胶原N端前肽(PⅠNP)Elisa试剂盒试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 96T0.8μg/L -24μg/L使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中Ⅰ型前胶原N端前肽(PⅠNP)含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠Ⅰ型前胶原N 端前肽(PⅠNP)水平。用纯化的大鼠Ⅰ型前胶原N 端前肽(PⅠNP)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入Ⅰ型前胶原N 端前肽(PⅠNP)，再与HRP 标记的Ⅰ型前胶原N 端前肽(PⅠNP)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的Ⅰ型前胶原N 端前肽(PⅠNP)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中大鼠Ⅰ型前胶原N 端前肽(PⅠNP)浓度。试剂盒组成1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶 7 终止液 6ml×1 瓶2 酶标试剂 6ml×1 瓶 8 标准品（48μg/L） 0.5ml×1 瓶3 酶标包被板 12 孔×8 条 9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶4 样品稀释液 6ml×1 瓶 10 说明书 1 份5 显色剂A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 张6 显色剂B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 个大鼠Ⅰ型前胶原N端前肽(PⅠNP)Elisa试剂盒标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3 的样品，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。24μg/L 5 号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液12μg/L 4 号标准品 150μl 的5 号标准品加入150μl 标准品稀释液6μg/L 3 号标准品 150μl 的4 号标准品加入150μl 标准品稀释液3μg/L 2 号标准品 150μl 的3 号标准品加入150μl 标准品稀释液1.5μg/L 1 号标准品 150μl 的2 号标准品加入150μl 标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。4. 配液：将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。操作程序总结：计算以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。注意事项1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔第一孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9．本试剂不同批号组分不得混用。10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。保存条件及有效期1．试剂盒保存：；2-8℃。2．有效期：6 个月Human PⅠNPFOR RESEARCH USE ONLYAssay range：2μg/L -48μg/L 96 determinationsPurposeThis kit allows for the determination of PⅠNP concentrations in Human serum, cellculture supernates and other biological fluidsPrinciple of the assayThe kit assay Human PⅠNP level in the sample，use Purified Human PⅠNP antibodyto coat microtiter plate wells, make solid-phase antibody, then add PⅠNP to wells, CombinedPⅠNP antibody which With HRP labeled,become antibody - antigen - enzyme-antibodycomplex, after washing Completely, Add TMB substrate solution,TMB substrate becomes bluecolor At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acidsolution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm.The concentration of Human PⅠNP in the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Materials provided with the kit1 wash solution 20ml×1bottle 7 Stopp Solution 6ml×1 bottle2 HRP-Conjugate reagent 6ml×1 bottle 8 Standard（96μg/L） 0.5ml×1 bottle3 Microelisa stripplate 12well×8strips 9 Standard diluent 1.5ml×1bottle4 Sample diluent 6ml×1 bottle 10 Instruction 15 Chromogen Solution A 6ml×1 bottle 11Closure platemembrane26 Chromogen Solution B 6ml×1 bottle 12 Sealed bags 1RDSpecimen requirements1. extract as soon as possible after Specimen collection,and according to the relevantliterature, and should be experiment as soon as possible after the extraction. If it can’t,specimen can be kept in -20 ℃ to preserve, Avoid repeated freeze-thaw cycles.2. Can’t detect the sample which contain NaN3, because NaN3 inhibits HRP active.Assay procedure1. Dilute and add sample:Dilute Original density Standard as follow table:48μg/L 5 Standard 150μl Original density Standard+150μl Standard diluent24μg/L 4 Standard 150μl 5 Standard+150μl Standard diluent12μg/L 3 Standard 150μl 4 Standard+150μl Standard diluent6μg/L 2 Standard 150μl 3 Standard +150μl Standard diluent3μg/L 1 Standard 150μl 2 Standard +150μl Standard diluent2.add sample：Set blank wells separately (blank comparison wells don’t add sample andHRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Sampledilution 40μl to testing sample well, then add testing sample 10μl (sample final dilution is5-fold), add sample to wells , don’t touch the well wall as far as possible, and Gently mix.3.Incubate: After closing plate with Closure plate membrane ,incubate for 30 min at 37℃.4.Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold) wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilledwater and reserve.5.washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing bufferto every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6.add enzyme：Add HRP-Conjugate reagent 50μl to each well, except blank well.7.incubate：Operation with 3.8.washing：Operation with 5.9.color：Add Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade thelight preservation for 15 min at 37℃10.Stop the reaction：Add Stop Solution50μl to each well, Stop the reaction(the blue colorchange to yellow color).11.assay：take blank well as zero , Read absorbance at 450nm after Adding Stop Solution andwithin 15min.Steps descriptionStandard, Sample diluentAdd Standard, Sample diluent, incubate for 30 min at 37℃.Wash 5 time,Add HRP-Conjugate reagent, incubate for 30 min at 37℃.Wash 5 times,Add Chromogen Solution A and B, incubate for 30 min at 37℃.Add Stopp SolutionRead absorbance at 450nm within 15 mincalculateCalculateTake the standard density as the horizontal, the OD value for the vertical ,draw thestandard curve on graph paper, Find out the corresponding density according to the sampleOD value by the Sample curve, multiplied by the dilution multiple, or calculate the straight lineregression equation of the standard curve with the standard density and the OD value ,with thesample OD value in the equation, calculate the sample density, multiplied by the dilution factor,the result is the sample actual density.Important notes1. The kit takes out from the refrigeration environment should be balanced 15-30 minutes inthe room temperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate shouldbe stored in Sealed bag.2. washing buffer will Crystallization separation, it can be heated the water helps dissolvewhen dilute . Washing does not affect the result.3. add Sample with sampler Each step, And proofread its accuracy frequently, avoids theexperimental error. add sample within 5 min, if the number of sample is much , recommendto use Volley .4. if the testing material content is excessively higher (The sample OD is bigger than the firststandard well ),please dilute Sample (n-fold), Please diluente and multiplied by the dilutionfactor.（×n×5）.5. Closure plate membrane only limits the disposable use, to avoid cross-contamination.6. The substrate evade the light preservation.7. Please according to use instruction strictly, The test result determination must take themicrotiter plate reader as a standard.8. All samples, washing buffer and each kind of reject should according to infective materialprocess.9. Do not mix reagents with those from other lots.Storage and validity1．Storage： 2-8℃.2．validity： six months大鼠Ⅰ型前胶原N端前肽(PⅠNP)Elisa试剂盒

   为回馈新老客户厚爱，我公司将从11月起，每月推出10种试剂盒特价促销，品质保障，活动期间还可以享受买5送1活动，买10送2，以此类推。具体详情请联系相关销售人员。YS00019B 人XC趋化因子受体1(XCR1)Elisa试剂盒正常值范围YS00020B 人二级淋巴组织趋化因子(SLC/CCL21)Elisa试剂盒正常值范围YS00021B 人E钙粘着蛋白/上皮性钙黏附蛋白(E-Cad)Elisa试剂盒正常值范围YS00022B 人骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)Elisa试剂盒正常值范围YS00023B 人骨成型蛋白受体1A(BMPR-1A)Elisa试剂盒正常值范围YS00024B 人骨成型蛋白4(BMP-4)Elisa试剂盒正常值范围YS00025B 人骨成型蛋白2(BMP-2)Elisa试剂盒正常值范围YS00026B 人β细胞素(BTC)Elisa试剂盒正常值范围YS00027B 人脑源性神经营养因子(BDNF)Elisa试剂盒正常值范围YS00028B 人血管生成素2(ANG-2)Elisa试剂盒正常值范围

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