新生小鼠星形胶质细胞原代培养及冻存条件

2015/02/28 14:19

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2015/02/28

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新生小鼠（24h内）星形胶质细胞原代培养及冻存由上海劲马实验室提供，欢迎来电咨询其他种属实验过程。材料：新生小鼠（24h内）一只，75%酒精，小烧杯两个，0.25%胰酶（含有0.3%EDTA），DMEM高糖培养基（10%FBS，4mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素），D-Hanks，冰块，冰袋，眼科剪3把，中号剪子一把，小号弯镊一把，直头镊两把，眼科镊两把，中号培养皿3个，十五毫升试管3个，小号培养皿一个。过程： 1、将小鼠头朝下放入盛有碎冰的小烧杯中，当看到尾巴变白时取出，再放入盛有75%酒精的小烧杯中，消毒大约1-2分钟。 2、在一号培养皿中将小鼠断头，去除头皮，马上移到2号皿中，用眼科剪剪开头骨。头骨打开后，用弯头镊子将大脑取出，放到3号皿中，用眼科镊去除大脑表面血管，并将皮质剥离，放到4号皿中。（2号皿，3号皿中预先放好滤纸，并用D-Hanks润湿，4号皿中预先放有500μl D-Hanks，所有培养皿都放在冰袋上）。用眼科镊将4号皿中的皮质剪碎（越碎越好），然后往4号中加入0.25%胰酶500μl。放入37°C孵箱孵育30分钟。 3、30分钟后，用吸管小心的将组织块移到盛有完全培养基（4ml）的1号试管中（移取时要小心，绝对不能吹打）。再将组织块移到盛有完全培养基（4ml）的2号试管中（移取时要小心，绝对不能吹打），在2号管中，进行吹打。吹打结束，静止3分钟左右后，用吸管将未消化的组织块移到有完全培养基（3ml）的3号试管中，同样进行吹打。吹打结束，静止3分钟左右后，用吸管将上清移到2号管中。将2号管中的细胞悬液用孔径75μm的滤网过滤。将过滤后的细胞悬液种植于培养瓶中。 4、种植后第三天换液，以后一周内换两次液 5、第十天，星形胶质细胞大约长满瓶底，移除培养基，再加入2-3ml后，将培养瓶密封好，在气浴摇床上以250rpm，37°C处理15小时。 6、15小时，换液或传代。冻存：方法与其他细胞方法相同，只是冻存液组份改为90%的FBS和10%DMSO。

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