在药物研发领域，您可能听说过高内涵筛选(HCS)以及与其密切相关的术语：高内涵成像(HCI)和高内涵分析(HCA)。但“高内涵”到底是什么意思？这些概念彼此之间有何不同？
这些术语经常与高通量筛选(HTS)的基本概念一起被提及，高通量筛选采用庞大的自动化机器人系统网络，能够测试数十万到数百万种化合物，从而有效缩小潜在候选药物的范围。在HTS的基础上，高内涵筛选(HCS)通过结合先进的显微镜和成像技术，进一步提高了这些能力，您可以测量许多不同的端点或输出，而不是仅仅测量一个端点。
本篇文章探讨了高内涵筛选（一个涵盖高内涵成像和高内涵分析的总称）如何通过捕获显示细胞对化合物反应的表型数据来增强药物研发过程。
高内涵成像 (HCI)：增强可视化
高内涵筛选的核心是高内涵成像(HCI)，这是一种基于图像的高通量方法，利用共聚焦显微镜、活细胞成像和自动多色荧光成像等显微镜技术。这种方法能够详细捕获细胞样本，从而同时分析2D和3D细胞培养中单个细胞的多个分子特征。从本质上讲，HCI提高了药物发现中细胞分析的深度和准确性，使科学家能够从细胞对潜在治疗化合物的反应中获得有价值的见解。以下是HCI在高内涵筛选中的主要应用：
1. 检测方法开发
通过提供详细的可视化，HCI帮助研究人员设计可靠的检测方法，可以准确测量特定的生物过程或终点，例如与疾病相关的细胞检测。这些检测方法可提供精确的测量并监测表型变化，从而有助于优化早期发现工作。例如，高通量管形成检测可作为一种体外工具，以简单、经济高效且可重复的方式评估血管生成，从而利用细胞的管形成能力来分析各种药物的促血管生成或抗血管生成潜力。同样，伤口愈合和迁移检测有助于分析不同条件下的细胞迁移，使其成为研究人员工具包中的宝贵补充。
除此之外，HCI还使研究人员能够生成既可预测又可转化为体内效应的临床前数据，尤其是与患者相关的3D类器官培养物相结合时。这种先进成像技术与3D类器官模型之间的协同作用提高了临床前评估的可靠性。
ibidi凭借µ-Plate 96 Well 3D为高通量管形成和3D细胞培养分析提供了解决方案。它提供了出色的细胞可视化效果，无弯液面，从而确保了可重复的细胞培养条件。即用型Culture-Insert 2 Well 24非常适合可重复的高通量伤口愈合和迁移分析。它由已插入µ-Plate 24 Well 的具有明确无细胞间隙的硅胶Culture-Insert插件组成。
2. 大规模转染试验
HCI广泛应用于大规模转染试验，是评估基因转染到细胞系统的有效性和效果的重要工具。HCI能够可视化和量化基因表达，使研究人员能够微调转染方案、了解基因功能并探索分子相互作用。
人类诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的神经元用MAP2染色，MAP2是细胞体和近端树突的标记。神经元通过神经原素2诱导分化，并与小鼠神经胶质细胞共培养30天。每个方格都从ibidi µ-Plate 96孔方格的单独孔中记录。图像记录在具有10倍物镜的高内涵共聚焦成像系统上。图片由美国马萨诸塞州剑桥Q-State Biosciences, Inc. 的Chris Hempel提供。
3. 化合物筛选
通过HCI，研究人员可以仔细研究化合物对细胞行为各个方面的影响，包括细胞形态、蛋白质表达和亚细胞定位等，所有这些都可以同时进行评估。这种多方面的分析有助于精确定位具有所需特性的化合物，从而高效、准确地推进药物研发工作。
例如， Schuth等人进行的研究强调了个性化PDAC共培养模型在全面分析药物反应和阐明导致肿瘤基质介导化学耐药性的分子机制方面的潜力。利用高内涵成像技术有助于揭示共培养环境中这些复杂的相互作用，为PDAC病理生物学和治疗策略提供宝贵见解。
PDAC-PDO单一培养和PDAC-PDO/CAF共培养的已建立药物测试工作流程示意图
4. 毒理学研究与安全性评估
HCI已成为毒性研究的基石，可用于评估潜在药物化合物或环境因素的安全性。它有助于监测细胞活力、细胞凋亡、氧化应激和其他毒理学终点，从而能够识别可能对细胞或组织造成风险的化合物或条件。
对于高内涵成像(HCI)来说，至关重要的是，板的底部必须既薄又平，以促进成像所需的光传输。在使用板进行HCI之前，研究人员需要验证它是否符合成像质量标准。
图左为：标准96孔板底部由聚苯乙烯制成，厚度为1毫米，不适合高分辨率或荧光显微镜。
图右为：ibidi96孔板带有平坦的ibidi聚合物盖玻片 #1.5底部(180µm,+10/-5µm)，非常适合高分辨率或荧光显微镜。
ibidi提供专门设计的微量滴定板，旨在满足这些应用的严格要求。ibidi的板有黑色方形和圆形孔，底部平坦、透明，可确保最佳成像质量。它们配有#1.5 ibidi聚合物盖玻片（µ-Plate 96孔方形孔和µ-Plate 96孔圆形孔）或#1.5H玻璃盖玻片底部（µ-Plate 96孔方形孔玻璃底、µ-Plate 96孔圆形孔玻璃底和µ-Plate 384孔玻璃底）
5. 活细胞分析
HCI非常适合活细胞分析，能够实时监测动态细胞过程。它有助于研究细胞行为，例如细胞迁移、细胞间相互作用和细胞内信号传导事件。HCI使得研究人员能够捕获延时图像并跟踪长时间内细胞表型的变化，为细胞动力学和对刺激的反应提供有价值的见解。
ibidi提供Stage Top加热孵育系统系统/活细胞工作站，用于使用具有ANSI/SLAS(SBS)标准格式的微孔板进行高通量活细胞成像。该系统可在倒置显微镜上轻松进行活细胞成像，精确控制温度、湿度、CO2 和O2。
高内涵分析（HCA）：解码复杂数据
高内涵分析是指利用自动化图像分析软件对高内涵筛选产生的海量数据进行分析。HCA可以分析图像中每个细胞的多个参数，每次实验处理数千个细胞。这包括对细胞形状、体积、质地和荧光强度在一系列波长范围内的变化进行量化。HCA已经发展到包括多细胞结构，如3D球体和共培养，以及多路复用能力，从而能够同时监测每个孔中单个微环境中的各种特征。
高内涵筛选的工作流程
高内涵筛选的最新趋势
近期HCS发展的一个主要趋势之一是机器学习和人工智能(AI)的集成。这些技术增强了HCS系统的分析能力，使其能够识别细胞图像中的模式和特征，这些模式和特征对于传统的分析方法来说可能过于微妙或复杂。例如，机器学习算法正被用于提高图像分析的准确性和速度，包括自动分类细胞类型、量化表型变化和预测细胞对不同处理的反应的能力。
另一个重要趋势是成像技术本身的进步。人们一直在努力开发更高分辨率和更快的成像系统，以便实时捕捉详细的细胞动态。超分辨率显微镜技术现在更频繁地与HCS平台配对，为细胞的分子机制提供了前所未有的见解。此外，多光谱成像技术允许同时检测多个荧光标记，从而促进对细胞相互作用和功能的复杂研究。
HCS的应用范围也在不断扩大，它能够处理的生物复杂性也越来越大。最近的创新推动了能够分析多细胞结构的系统的发展，例如类器官和3D细胞培养。这些3D培养物可以更好地模拟人体内细胞的自然环境，为筛选药物和了解疾病机制提供了新的方法，与临床结果有更高的相关性。
参考文献：
Schuth, S., Le Blanc, S., Krieger, T.G. et al. Patient-specific
modeling of stroma-mediated chemoresistance of pancreatic cancer using a
three-dimensional organoid-fibroblast co-culture system. J Exp Clin
Cancer Res 41, 312 (2022).
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