植物体内可溶性蛋白含量的测定原理

一、原理

    LoWry法是双缩脲法（Biuret）和福林酚法（Folin-酚）的结合与发展.其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后,碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应,形成铜—蛋白质的络合盐.再加入酚试剂后,在碱性条件下,这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定,很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸,使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物.这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关,所以可以用于蛋白质含量的测定.ELISA试剂盒LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外,还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈,其显色效果比单独使用酚试剂强3-15倍,约是双缩脲法的100倍.由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差.LoWry法适于微量蛋白的测定,对多个样品同时测定较为方便.但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理（如加入少量的SDS）.

1、双缩脲法的原理

    双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物,这一反应称为双缩脲反应.因为蛋白质中有多个肽键,也能与铜离子发生双缩脲反应,且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律,而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关,所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量.

    双缩脲反应主要涉及肽键,因此受蛋白质特异性影响较小.且使用试剂价廉易得,操作简便,可测定的范围为1-10mg蛋白质,适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定,能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上.双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大.干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液,ELISA试剂盒如Tris缓冲液,因为它们产生阳性呈色反应,铜离子也容易被还原,有时出现红色沉淀.

2、福林-酚法的原理

    该方法是双缩脲法的发展,包括两步反应：

    1）在碱性条件下,蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物.

    2）此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸（Folin试剂）还原,混合物深蓝色（磷钼蓝和磷钨蓝混合物）,颜色深浅与蛋白质含量成正比.此方法操作简便,灵敏度比双缩脲法高100倍,定量范围为5-100μg蛋白质.Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起,因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物,均有干扰作用.此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响,即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同,标准曲线也不是严格的直线形式.

20mg 款冬酮 供含量测定用 111884-201001

20mg 蟛蜞菊内脂 供含量测定用 111885-201001

20mg 旱莲苷A 薄层色谱 111886-201001

20mg 太子参环肽B 供含量测定用 111887-201001

20mg 对羟基苯乙酮 供含量测定 111897-201001

20mg 芫花素（暂行） 供含量测定 111899-201001

20mg 橙黄决明素（暂行） 供含量测定用 111900-201001

20mg 芹菜素 供含量测定用 111901-201001

ELISA试剂盒20mg 人参皂苷Ro 供鉴别用 111903-201001

20mg 山麦冬皂苷B 供鉴别用 111907-201001

20mg 短亭山麦冬皂苷C 供鉴别用 111908-201001

鲁斯可皂苷 111909-201001

20mg 木通苯乙醇苷B     （荷苞花苷） 含量测定 111910-201001

10mg 通关藤苷H 供含量 111913-201001

2.5g 千斤拔 TLC法鉴别 121502-200501