流式细胞仪检测细胞凋亡

上海盈公

2015/05/14 11:14

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经固定的凋亡细胞其染色体荧光染料的DNA可染性性下降.细胞一经固定就不再是活细胞,而且细胞固定过程对细胞膜的通透性也有影响.因此发展了用 “细胞活性”鉴定染料染色的流式细胞仪检测方法.这些方法细胞不经固定就直接用DNA染料染色,且染料的浓度要比固定细胞所用的浓度要低得多.流式细胞仪通常根据细胞膜完整性将细胞分为“活细胞”和“死细胞”,因此正常细胞和凋亡细胞归为活细胞.活细胞染料如Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用.Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高,Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度增高的机制与凋亡细胞膜通透性发生改变有关,凋亡细胞早期细胞膜的完整性没有明显性改变,但细胞膜的通透性已有增强,因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多.此外,还与凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合以及凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst 33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等有关.
既然Hoechst 33342进入凋亡细胞中比正常细胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能进入细胞膜完整的活细胞中,即正常细胞和凋亡细胞在不经固定的情况下对这些染料是拒染,坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损,可被这些染料染色.根据这些特性,用Hoechst 33342结合PI或EB等染料对凋亡细胞进行双染色,就可在流式细胞仪上将正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞区别开来.在双变量流式细胞仪的散点图上,这三群细胞表现分别为：正常细胞为低蓝色/低红色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡细胞为高蓝色/低红色(Hoechst 33342++/PI+),坏死细胞为低蓝色/高红色(Hoechst 33342+/PI++).