1. 使用前,将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。
2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer,并于室温保存。
D6948-00B: 加入8ml无水乙醇
D6948-01B: 加入80ml无水乙醇
D6848-02B: 加入80ml无水乙醇
1. 取1.5-5ml 菌液10,000 x g室温离心1min收集菌体沉淀;
2. 小心去除上清液,加250ul Solution I/RNase,涡旋或用移液枪上下吹打重悬菌体。
3. 加250ul SolutionⅡ,来回颠倒4- 6次轻柔混匀,得到澄清的裂解液。
4. 加125ul Buffer N3,颠倒混匀几次直至出现白色絮状沉淀,室温放置2-3min让其充分反应。
5. 12,000×g 室温或4℃离心10min得上清,把上清转移到一个新的离心管内;
6. 加入与上清等体积的ETR Binding Buffer,颠倒混匀7-10次,室温放置5min。
7. 结合质粒——把结合柱插入2ml收集管,每次转移700ul混合液至结合柱柱里,8,000×g离心1min,弃滤液。
8. 重复第7步,直至所有上清都过滤完,弃滤液。
9. 加入500ul ETR Wash Buffer到结合柱上,8,000×g离心1min,使全部液体滤过柱子,弃滤液。
10. 加入500ul Buffer EHB到结合柱上,8,000×g离心1min,使全部液体滤过柱子,弃滤液;
11. 加入700ul DNA Wash Buffer到结合柱上, 8,000×g离心1min使全部液体滤过柱子,弃滤液;
注意:浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。
12. 加入700ul DNA Wash Buffer到结合柱上,8,000×g离心1min使全部液体滤过柱子,弃滤液;
13. 把空柱子套回离心管,最大转速(不超过13,0 0 0×g)离心2min干燥柱子;
14. 把结合柱套在一个新的1.5ml离心管中,加入30-50ul Endotoxin-Free Elution Buffer,室温放置2-5min,最高转速离心1min洗脱质粒DNA。
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