免疫荧光染色荧光信号较弱原因+解决方法

　　免疫荧光（immunofluorescence）是一种常用的光学显微术，即用荧光显微镜来观察细胞中的特定生物分子。免疫荧光依赖于该生物分子的抗体对抗原的特异性结合，然后通过直接标记或间接标记方法使用荧光分子指征抗体-抗原结合的位置，以确定目标生物分子在细胞中的位置、丰度和其他分布情况。
　　
　　接下来一起了解一下免疫荧光染色荧光信号较弱的原因和可能的解决方案吧。
　　
　　1、信号放大程度过低→信号弱或无信号
　　
　　根据靶点的表达情况，免疫荧光有多种信号放大实验方案可以选择。如果目标分子不是高表达的，信号放大方案选择不当就很可能导致免疫荧光信号弱，甚至没有信号的问题。
　　
　　如果靶点是中低丰度的蛋白质，普通的荧光基团偶联的二抗标记可能不能得到优异的信号，则需要信号放大程度更高的方法，或亮度更高的荧光基团偶联二抗进行信号提升。
　　
　　如果靶点是低丰度的蛋白质，可能需要信号放大倍数更高的方法，比如酪胺信号放大技术，来进一步增强信号，从而轻松检测到低丰度、难以检测到的蛋白。
　　
　　2、抗体选择错误→信号弱或无信号
　　
　　由于免疫荧光实验的核心原理是待检测靶点的抗体对靶点的特异性识别，抗体的选择是免疫荧光实验至关重要的步骤，使用正确且有效的抗体是特异性、灵敏的靶点检测的前提，也是拍到高分辨率、清晰的图像的先决条件。
　　
　　免疫荧光实验信号弱可能由哪些的抗体相关的问题引起的呢？我们要怎么解决或规避这些问题呢？
　　
　　一抗不适用于免疫荧光
　　
　　在为任何基于抗体的检测实验选择抗体时，不仅仅要考虑特定抗体是不是针对待测靶点的，还要考虑到该抗体是不是可以用于目标的检测方法，以及抗体的方法适用性是不是经过验证的、有没有相应的数据支持。
　　
　　一抗和二抗不匹配
　　
　　选择二抗的时候要根据一抗的种属来源和类别亚型进行选择，例如，如果一抗的宿主/亚型是Mouse / IgG2b，则二抗可以选择抗Mouse IgG，或者专门选择抗Mouse IgG2b。
　　
　　如果使用一抗和二抗在上述的几个方面不匹配，则可能导致免疫荧光信号弱或无信号，提高二抗的特异性相应可以优化免疫荧光实验的结果。
　　
　　抗体过期或失效
　　
　　在开始免疫荧光实验前应确保抗体已妥善储存，并还在效期内，否则可能出现抗体失效的情况，继而影响实验结果和实验进度。
　　
　　如果样品较为珍贵，但无法确定抗体效果，可做预实验确保抗体的有效性和是否需要进一步信号优化。
　　
　　3、试剂过期或失效→信号弱或无信号
　　
　　免疫荧光实验涉及的各个步骤都会使用到相应的试剂，这些试剂的过期、失效或选择不当可能导致免疫荧光实验信号弱或无信号，比如固定液4% 多聚甲醛需现配现用，如放置太久会发生醛基氧化、影响染色效果。