1%琼脂糖电泳制胶常见问题与解决办法

　　配制步骤如下：

　　1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液。

　　2.胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

　　常见问题解决方法

　　1. DNA条带模糊，拖尾。

　　（1）DNA降解。避免核酸酶污染。

　　（2）DNA上样量过多。减少凝胶中DNA上样量。

　　（3）电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。

　　（4）电泳条件不合适。电泳时电压不应超过20 V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

　　（5）DNA样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

　　（6）有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。

　　（7）DNA变性。电泳前勿加热，用20 mM NaCl缓冲液稀释DNA。

　　2. DNA条带淡弱或无DNA带。

　　（1）DNA的上样量不够：增加DNA的上样量。

　　（2）DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

　　（3）DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

　　（4）分子大小相近的DNA带不易分辨。增加电泳时间，使用正确的凝胶浓度。

　　（5）DNA变性：电泳前请勿高温加热DNA链，用20 mM NaCl Buffer稀释DNA。

　　（6）DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。

　　3. DNAMARKER条带扭曲。

　　（1）配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液面1~2 mm即可。

　　（2）电泳时电压过高。可以在电泳前15分钟用较低电压（3 V/cm），等条带出孔后，再调电压。

　　（3）尽量慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。