BCA蛋白浓度试剂盒测定方法+注意事项

测定方法1：（试管法）
1、配制工作液: 根据标准品和样品数量，按50 体积试剂A，1 体积试剂B 配制适量BCA 工作液，充分混匀。注意：BCA 工作液室温24 小时内稳定。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做2-3 个平行反应。本处列举的比色体系所用的是0.5ml 的比色杯；如果没有0.5ml 比色杯，反应体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。
2、BSA 标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲配置，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备3 个平行测定。标准曲线一般5-6个点即可，根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释BSA 时,可以用水或与样品一致溶液。如待测定的浓度为200μg/ml 左右，按次序加入BSA 标准品、样品及BCA 工作液。
3、取适当体积的标准蛋白（蛋白样品）以蛋白液：工作液为1：20 的比例混匀，37℃温浴30min，冷却至室温。
4、将样品与标准品在562nm 波长下测定吸光度。绘制标准曲线，通过标准曲线计算样品的浓度。注意: 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。

测定方法2：（96孔板）
1、配制BCA 工作液: 根据标准品和样品数量，按50 体积试剂A，1 体积试剂B 配制适量BCA 工作液，充分混匀。
2、将蛋白标准品按0, 1, 2, 4, 6，8, 10 微升加到96 孔板的蛋白标准品孔中，加灭菌双蒸水补足到10 微升；取10 微升待测样品加入96 孔板。每个测定要做2-3 个平行.
3、向带测样品孔和蛋白标准品孔中加入200 微升BCA工作液（即样品与工作液的体积比为1：20）混匀。
4、37℃温浴30min。冷取至室温。
5、酶标仪562nm 波长下测定吸光度。
6、制作标准曲线，从标准曲线中求出样品浓度。

注意事项：
1、反应颜色的深浅除了与样品的蛋白质浓度相关外，还与反应的温度有关。如果样品的浓度较高（>50μg/ml），反应温度一般采用37 度。如果样品蛋白质的浓度较低（<50μg），反应的温度为60℃，该温度下，色氨酸、酪氨酸和肽键得到充分氧化，大大提高检测灵敏度。
2、该方法检测的蛋白质浓度范围20μg-500μg/ml；当蛋白浓度＜20ug/ml 时，推荐60℃温浴，并将蛋白液：工作液的比例调至1：8 进行测定（增强法）可以检测到5ug/ml。试剂A 和B 在室温的稳定期至少1 年以上。标准蛋白液保存在－20℃,短期则4℃保存