PCR实验失败原因与解决方法

2024/03/05 11:06

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应用领域：

生物产业

发布时间：

2024/03/05

检测样品：

其他

检测项目：

PCR试剂

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参考标准：

方案摘要：

普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异带。在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr，没关系的三Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。

产品配置单：

所需试剂

一步法RT-qPCR试剂盒

型号： 100 rxns

产地：

品牌：远慕

¥1

参考报价

方案详情：

一、模板质量问题：

1）模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑个电泳看看提取的DNA，PCR阳性样品与阴性样品是否有明显差别。如果确定是这种问题，可以增加模板量试试，但不一定行得通。

2）模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。

3）为什么跑电泳会出现拖带呢？

1. 有可能的因为你的电压调的太高了。电泳跟很多因素有关，其中就有一个是电压，在适当的电压范围内增加是可以加快迁移速率，但是要是超到一个临界值反而有害。你可以适当的调低点看看。

2.有时候发现上样量太多的话会有拖带。你看能否回收之后，按1:50 或1:100 等稀释后，再当成模板扩一次怎么样。

二、引物问题

1）样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以换一对更保守的引物试试。祝顺利！

2）普通PCR所用的一对引物中有一个引物加多了，为正常的三倍只要引物特异性比较好，那么不会产生大的影响。如果恰巧是加多的这条引物不是很特异的话，也许会扩出来非特异带。

在制备单链探针时候就采取这样的不对称pcr，没关系的三Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。

三、Taq酶处于失活状态。因为活性降低了能出现二聚体。

四、模板浓度过低。

五、退火温度过高。有可能，可以做个梯度PCR试一下。

六、循环次数过少或延伸时间过短以致目的基因扩增量不够。这个可能性不大。

七、dNTP浓度低时PCR产率及特异性均增高，适合于用扩增掺入法标记生物素及放射性元素。当100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L时就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,会很影响PCR结果,即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

八、PCR产物电泳

1.电泳图不清晰，可能电泳缓冲液和制胶缓冲液浓度不准或者脏了吧。换新的电泳缓冲液和制胶缓冲液试试。

marker都出问题说明是你的胶的问题，或者电泳操作的问题。

2. PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。