人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)ELISA试剂盒说明书

人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)使用目的：
本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)含量。

人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)水平。用纯化的人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)，再与HRP标记的黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人黏膜地址素细胞黏附分子(MAdCAM-1)浓度。
 
试剂盒组成：
Reagent    Quantity
酶标包被板    12well×8strips
标准品      1600pg/ml    1×0.5ml
标准品稀释液    1×1.5ml
酶标试剂    1×6ml
样品稀释液    1×6ml
显色剂A液    1×6ml
显色剂B液    1×6ml
终止液    1×6ml
30倍浓缩洗涤液    1×20ml×30flod
说明书    1
封板膜    2
密封袋    1

样本处理及要求：
1.  血清：室温血液自然凝固  10-20  分钟，离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.  血浆：应根据标本的要求选择  EDTA  或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合  10-20  分钟后，离心 20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.  尿液：用无菌管收集，离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.  细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心  20  分钟左右（2000-3000 转/分）  。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用  PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到  100  万/ml  左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.  组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的  PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持  2-8℃的温度。加入一定量的  PBS（PH7.4）  ，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.  标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7.  不能检测含  NaN3  的样品，因  NaN3  抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：
1. 标准品：其浓度为1600pg/ml(贮液)。先将其稀释为1600pg/ml（标准曲线最高浓度)后，再准备5个稀释标准品的EP 管，每个EP 管中加入150μL 的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成1600pg/ml，800pg/ml，400pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml标准品稀释液（0pg/ml）直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液
Tube    0    1    2    3    4    5
pg/ml    1600pg/ml    800pg/ml    400pg/ml    200pg/ml    100pg/ml    50pg/ml
 2.  加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）  、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液  40μ l，然后再加待测样品  10μ l（样品最终稀释度为  5  倍）   。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.  温育：用封板膜封板后置  37℃温育  30  分钟。
4.  配液：将  20  倍浓缩洗涤液用蒸馏水  20  倍稀释后备用。
5.  洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置  30  秒后弃去，如此重复  5  次，拍干。
6.  加酶：每孔加入酶标试剂  50μ l，空白孔除外。
7.  温育：操作同  3。
8.  洗涤：操作同  5。
9.  显色：每孔先加入显色剂  A50μ l，再加入显色剂  B50μ l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15  分钟.
10.  终止：每孔加终止液  50μ l，终止反应（此时蓝色立转黄色）  。
11.  测定：以空白空调零，450nm  波长依序测量各孔的吸光度（OD  值）  。 测定应在加终止液后  15  分钟以内进行。

注意事项：
1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡  15-30  分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本  OD
值大于标准品孔第一孔的  OD  值）  ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n  倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）  。
5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．  底物请避光保存。
7．  严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．  所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．  本试剂不同批号组分不得混用。

计算：                                        
以标准物的浓度为横坐标，OD  值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与  OD  值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD  值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数  R  值为  0.990  以上。
2.批内与批见应分别小于  9%和  11%
3.保存条件及有效期：
a.试剂盒保存：2-8℃。
b.有效期：6  个月