人淋巴细胞因子ELISA试剂盒实验步骤

产品名称：人淋巴细胞因子ELISA试剂盒
英文名称：Human lymphocyte factor ELISA Kit
试剂盒保存：保质期六个月，保存环境2-8℃(频繁使用时)；-20℃(较长时间不用时)。
规格：48T/96T
检测方法：酶联免疫法/酶免法（ELISA）
使用范围：仅供科研检测,不得用于临床

ELISA试剂盒组成部分：
试剂盒组成    48 孔配置    96 孔配置保存
说明书    1份    
封板膜    2 片（48）    2 片（96）
密封袋    1个    1个
酶标包被板    1×48     1×96
标准品    225nmol/L 0.5ml×1 瓶    0.5ml×1 瓶
标准品稀释液    1.5ml×1 瓶    1.5ml×1 瓶
酶标试剂    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
样品稀释液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
显色剂A液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
显色剂B液    3 ml×1 瓶    6 ml×1 瓶
终止液    3ml×1 瓶    6ml×1 瓶
浓缩洗涤液    （20ml×20 倍）×1 瓶    （20ml×30 倍）×1 瓶

实验准备工作：
1、试剂配制:洗涤液按1:20三蒸水稀释;标准品在用前每管加入200 ?l蒸馏水溶解即可(具体见说明书);底物工作液应在显色前5-10 min将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加5 ml液。
2、标本收集:采集血清或体液尽早检测,2~8 ℃保存一天需更长时间须冷冻(-20℃)保存,避免反复冻融;组织(胎肝、胎脑等)实验前一天组织匀浆,用90%体积RIPA裂解液(PH 8.0,50 mM Tris HCl、1% NP-40、,0.25% sodium deoxycholate、150 mM NaCl、1 mM EDTA)和10%体积的10 mM PMSF进行组织匀浆(10%),冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4℃待用。
3、器材准备:酶标仪、37 ℃恒温烤箱、滤纸、托盘、量筒、烧杯、各种规格的移液器、离心管、管架和废液缸等。三蒸水自备。

人淋巴细胞因子ELISA试剂盒操作步骤：
1、设立标准孔8孔(根据样品蛋白浓度可调整为6孔),每孔中先各加入样品稀释液100 ul,第一孔再加标准品100 ul,混匀后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第7孔,最后,从第7孔中吸出100 ul弃去,使之体积均为100 ul。第8孔为空白对照。
2、加样:待测样品孔中每孔各加入待测样品100ul。
3、将反应板置于37 ℃×120 min。
4、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上扣干。
5、每孔中加入第一抗体工作液50ul。
6、将反应板充分混匀后置37 ℃×60 min。
7、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。
8、每孔加酶标抗体工作液100ul。
9、将反应板置于37 ℃ 120 min。
10、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。
11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗处反应5~10 min。
12、每孔中加入50ul终止液混匀。
13、用酶标仪在492 nm处测吸光值。

计算结果与判断：
1、以标准品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。
2、所有OD值都应减去空白管值后再计算。
根据样品OD值在该标准曲线图上查出或根据标准曲线公式换算出相应样品中TNF-a含量。

注意事项：
1、以上标准孔及待查样品均建议做复孔,每次测定均要做标准孔。
2、本试剂盒宜置-20 ℃冷藏保存。
3、本人ELISA试剂盒取出的试剂在室温(20~25 ℃)环境下使用,溶液应轻轻摇匀后使用。
4、本试剂盒含2M硫酸,不要将它与含叠氮化钠的废物混在一起。
5、板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。
6、避免交叉污染。如洗涤时向样品待测蛋白含量可能高的一侧倾倒。
7、提前24 h打开烤箱预热。
8、底物工作液应在显色前5~10 min配制。若配制时间过长,会变质。
9、甩尽孔内液体,每孔加350 ul左右洗涤液,静止30 s后甩尽。尤其加抗体工作液或底物时尽量弄干孔内液体。且孵育过程中要盖住各反应孔,防止液体恢复。
10、尽量防止样品待测蛋白浓度过高而出现酶标仪显示out。当酶标仪测定值出现许多out时,可通过稀释一定倍数后用可见光分光计测定,所有孔均同时测定.