人肽-主要组织相容性复合体复合物(pMHC)ELISA试剂盒操作步骤

人肽-主要组织相容性复合体复合物(pMHC)ELISA试剂盒说明书
                     
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：25 ng/L -800 ng/L
使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本肽-主要组织相容性复合体复合物（pMHC）含量。

实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肽-主要组织相容性复合体复合物（pMHC）水平。用纯化的人肽-主要组织相容性复合体复合物（pMHC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肽-主要组织相容性复合体复合物（pMHC），再与HRP标记的肽-主要组织相容性复合体复合物（pMHC）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肽-主要组织相容性复合体复合物（pMHC）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肽-主要组织相容性复合体复合物（pMHC）浓度。

试剂盒组成
1.20倍浓缩洗涤液.20ml×1瓶.7.终止液.3ml×1瓶
2.酶标试剂.3ml×1瓶.8.标准品（1600ng/L）.0.5ml×1瓶
3.酶标包被板.12孔×4条.9.标准品稀释液.1.5ml×1瓶
4.样品稀释液.3ml×1瓶.10.说明书.1份
5.显色剂A液.3ml×1瓶.11.封板膜.2张 
6.显色剂B液.3ml×1/瓶.12.密封袋.1个

标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
800 ng/L.5号标准品.150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
400 ng/L.4号标准品.150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
200 ng/L l.3号标准品.150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
100 ng/L.2号标准品.150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
50 ng/L.1号标准品.150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液
2. 加 样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样 品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。   
4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4． 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月