人利钾尿肽(KP)ELISA试剂盒操作步骤

　　产品名称：人利钾尿肽(KP)ELISA试剂盒

　　英文名称:Human kaliuretic peptide,KP ELISA kit

　　存储条件：4℃保存

　　有 效 期：6个月

　　产品规格：96T/48T

　　适用范围：此试剂盒仅用于科研实验！

　　实验准备工作

　　1、试剂配制:洗涤液按1:20三蒸水稀释;标准品在用前每管加入200 ?l蒸馏水溶解即可(具体见说明书);底物工作液应在显色前5-10 min将OPD片放入底物稀释液中溶解,每片加5 ml液。

　　2、标本收集:采集血清或体液尽早检测,2~8 ℃保存一天需更长时间须冷冻(-20℃)保存,避免反复冻融;组织(胎肝、胎脑等)实验前一天组织匀浆,用90%体积RIPA裂解液(PH 8.0,50 mM Tris HCl、1% NP-40、,0.25% sodium deoxycholate、150 mM NaCl、1 mM EDTA)和10%体积的10 mM PMSF进行组织匀浆(10%),冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4℃待用。

　　3、器材准备:酶标仪、37 ℃恒温烤箱、滤纸、托盘、量筒、烧杯、各种规格的移液器、离心管、管架和废液缸等。三蒸水自备。

　　操作步骤

　　1、设立标准孔8孔(根据样品蛋白浓度可调整为6孔),每孔中先各加入样品稀释液100 ul,第一孔再加标准品100 ul,混匀后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反复作对倍稀释至第7孔,最后,从第7孔中吸出100 ul弃去,使之体积均为100 ul。第8孔为空白对照。

　　2、加样:待测样品孔中每孔各加入待测样品100ul。

　　3、将反应板置于37 ℃×120 min。

　　4、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次,向滤纸上扣干。

　　5、每孔中加入第一抗体工作液50ul。

　　6、将反应板充分混匀后置37 ℃×60 min。

　　7、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

　　8、每孔加酶标抗体工作液100ul。

　　9、将反应板置于37 ℃ 120 min。

　　10、洗板:用洗涤液将反应板充分洗涤4~6次,向滤纸上扣干。

　　11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 ℃暗处反应5~10 min。

　　12、每孔中加入50ul终止液混匀。

　　13、用酶标仪在492 nm处测吸光值。

　　人利钾尿肽(KP)ELISA试剂盒计算结果与判断

　　1、以标准品 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 pg/ml之OD值在半对数纸上作图,画出标准曲线。

　　2、所有OD值都应减去空白管值后再计算。

　　根据样品OD值在该标准曲线图上查出或根据标准曲线公式换算出相应样品中TNF-a含量。

　　人利钾尿肽(KP)ELISA试剂盒注意事项

　　1、以上标准孔及待查样品均建议做复孔,每次测定均要做标准孔。

　　2、本试剂盒宜置-20 ℃冷藏保存。

　　3、本人ELISA试剂盒取出的试剂在室温(20~25 ℃)环境下使用,溶液应轻轻摇匀后使用。

　　4、本试剂盒含2M硫酸,不要将它与含叠dan化钠的废物混在一起。

　　5、板条开封后剩余板条要再封好,保持板条干燥。

　　6、避免交叉污染。如洗涤时向样品待测蛋白含量可能高的一侧倾倒。

　　7、提前24 h打开烤箱预热。

　　8、底物工作液应在显色前5~10 min配制。若配制时间过长,会变质。

　　9、甩尽孔内液体,每孔加350 ul左右洗涤液,静止30 s后甩尽。尤其加抗体工作液或底物时尽量弄干孔内液体。且孵育过程中要盖住各反应孔,防止液体恢复。

　　10、尽量防止样品待测蛋白浓度过高而出现酶标仪显示out。当酶标仪测定值出现许多out时,可通过稀释一定倍数后用可见光分光计测定,所有孔均同时测定.