人P53(P53)ELISA试剂盒使用方法

　　【产品名称】: 人P53(P53)ELISA 试剂盒

　　【英文名称】: Human p53/tumor protein,p53/TP53 ELISA Kit

　　【检测种属】：人、大鼠、小鼠、豚鼠、猪、兔子、植物等

　　【产品规格】：96T/48T

　　【检测方法】：酶免法/酶联免疫法(ELISA)

　　【保存条件】：2-8℃

　　温馨提示：仅供科研使用，不得用于临床！

　　实验原理:

　　本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人P53水平。用纯化的人P53抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入P53，再与HRP标记的P53抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的P53呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人P53浓度。

　　标本要求

　　1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

　　2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

　　操作步骤

　　实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

　　1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。

　　为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

　　2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。

　　3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

　　4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100μl，37℃，60分钟。

　　5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。

　　6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。

　　7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

　　8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15分钟以内进行检测。