明胶酶谱实验

明胶酶谱法可用于：（1）明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9）的测定；（2）测定明胶酶的抑制剂；（3）细胞与组织中明胶酶的定位。

实验方法原理     

细胞外基质（ECM）是细胞生存的重要内环境，不仅含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖等成分，而且含有大量的蛋白酶、细胞因子、黏附分子。ECM，尤其是其中的基底膜，是肿瘤转移过程中必须克服的生理屏障。基质金属蛋白酶家族（MMPs）可以降解细胞外基质，帮助肿瘤细胞克服这一屏障

并为细胞增殖提供空间。MMP2、MMP9是主要降解基底膜上IV型胶原和明胶的基质金属蛋白酶类，与恶性肿瘤浸润转移的关系尤为密切，通过蛋白电泳即可检测MMP2，MMP9的活性。

实验材料     

细胞匀浆 组织提取物

试剂、试剂盒     

聚丙烯酰胺凝胶 明胶 浓缩胶 Tris-甘氨酸缓冲液 Triton X-100 过硫酸铵 甲醇 醋酸 考马斯亮蓝 蛋白质上样缓冲液

仪器、耗材  

电泳糟 pH计 凝胶成像仪 离心机 电泳仪 细胞培养瓶 倒置显微镜 超净台 高压蒸汽灭菌锅 电子天平 液氮罐 微型旋转柱 旋转混合仪

实验步骤:

一、主要试剂的配制

1. 平衡缓冲液：50 mmol／L Tris（pH7.5），0.5 mol／L NaCl，10 mmol／LCaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol／L 邻二氮菲。

2. 洗涤缓冲液1：50 mol／L Tris（pH7.5），0.5 mmoL／L NaCl，10 mmol／L CaCl2，0.05％Tween 20，5 mmol／L邻二氮菲。

3. 洗涤缓冲液2：50 mmol／L Tris（pH7.5），10 mmoL／L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol／L邻二氮菲。

4. 8％分离胶（含0.1％明胶）：30％丙烯酰胺2.7 ml，ddH20 4.5 ml，1.5 mol／L Tris（pH 8.8）2.5 ml，10％ SDS 100 μl，10％ 过硫酸铵（APS） 100 μl，TEMED 6 μl。

5. 浓缩胶：ddH20 2.1 ml，30％丙烯酰胺0.5 ml，1 mol／L Tris-HCI（pH6.8）0.38 ml，10％SDS 30 μl，10％过硫酸铵30 μl，TEMED 3 μl。

6. 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：0.125 mol／L Tris-HCl，1.25 mol／L甘氨酸，0.5％SDS。

7. 5×上样缓冲液：30％ 1 mol／L Tris-HCl（pH6.8），25％甘油，0.05％溴酚蓝。

8. 洗脱液：2.5％ TritonX-100（去离子水定容）。

9. 孵育液：50 mmoL／L Tris-HCl，10 mmol／L CaCl2，1％ TritonX-100，pH7.5，去离子水定容。

10. 染色液：0.25％考马斯亮蓝R-250，45％甲醇，10％乙酸。

11. 脱色液：30％甲醇，10％乙酸。

二、实验方法

1. 收集生长对数期的癌细胞培养液。

2. 将500μl培养液，45μl明胶琼脂糖颗粒（使用前混匀）和45μl平衡缓冲液混合均匀后加入微型旋转柱中，于旋转混合仪上平衡30min。

3. 用洗涤缓冲液1洗涤琼脂糖颗粒，每次100μl洗涤3次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液1。

4. 用100μl洗涤缓冲液2洗涤琼脂糖颗粒1次，7000r/min离心除去洗涤缓冲液2。

5. 向微型旋转柱中加入40μl的2x上样缓冲液，7000r/min离心。将离心后的上样缓冲液重新加入微型旋转柱中，于12000r/min离心10s。

6. 采用8%分离胶在130V恒压下电泳2.5h。

7. 用洗脱液在摇床上洗涤蛋白胶2次，各30min，除去胶中的SDS。

8. 37℃孵育蛋白胶24h，使MMP分解明胶。

9. 摇床上染色1h及脱色至条带清晰。

10. 蛋白成像：用凝胶成像仪进行拍照。

注意事项     

1. 制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2. 明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子和pH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度要控制好。

3. 为防止样品中的酶变性失活，禁忌煮沸蛋白样品，且上样缓冲液中不能含β-巯基乙醇或DTT。

4. 孵育液的pH最hao在7.5——7.6，复性的Triton放置时间过长会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的溶液。

5. 孵育的37℃不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的pH值，在普通孵箱即可。

6. 明胶要4℃保存，配好后1周内使用。