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丹磺酰化法分析蛋白质 N-末端氨基酸实验
2019/08/27 10:23
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方案摘要：
产品配置单：
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方案详情：
实验原理:
蛋白质的α-氨基与丹磺酰氯(DNS-Cl 是一种荧光物质) 反应, 生成DNS-蛋白质, 经水解可生成DNS-氨基酸。通过聚酰胺薄膜层析分析DNS-氨基酸, 可确定蛋白质的N-末端氨基酸。此法灵敏度高, 也可用于蛋白质的氨基酸组成的测定。聚酰胺对极性物质的吸附作用是: 它能和被吸附物质间形成氢键, 这种氢键的强弱决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离物在聚酰胺表面发生吸附、解吸附、再吸附和再解吸附的连续过程, 就能导致分离物达到分离的目的。
实验材料:蛋白质
试剂、试剂盒:氨基酸 丙酮 丹磺酰氯 盐酸 碳酸氢钠 甲酸 水 苯 冰醋酸 乙酸乙酯 甲醇 冰乙酸 磷酸三钠 乙醇 三乙胺
仪器、耗材:真空干燥器 水解管 烘箱 紫外分析灯 玻璃试管 聚酰胺薄膜
实验操作步骤:
1. 标准氨基酸的丹磺酰化
分别称取2 . 3μmol 层析纯的氨基酸, 溶于0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L碳酸氢钠溶液中。取0 . 1 ml 于有塞玻璃试管中, 加入0.1 ml DNS-Cl 丙酮溶液, 检查pH, 必要时用三乙胺调pH9 . 0～ 9 . 5 ,于室温(25 ℃ 左右) 下放置2～ 4 h。再用无离子水稀释10 倍,贮存于暗处。经层析, 得DNS-氨基酸的标准图谱。
2. 蛋白质N-末端氨基酸的DNS 化
取0 . 5 mg 蛋白质样品, 置于有塞玻璃管中。用少量水溶解后, 加入0 . 5 ml 0 . 2 mol/ L 碳酸氢钠溶液。再加入0 .5 mlDNS-Cl丙酮溶液, 用三乙胺调至pH9 . 0～9 . 5 , 塞好塞子, 于40 ℃ 烘箱中反应2 h , 或室温(25 ℃左右)放置2～4 h , 生成DNS-蛋白质。
3. DNS-蛋白质的水解
DNS 化反应结束后, 真空蒸去丙酮, 加入0 . 5 ml 6 mol/ L 盐酸溶解DNS-蛋白质。全部移入水解管, 抽真空封管, 于111 ℃烘箱中水解18～24 h。开管后蒸去盐酸, 加少量水, 再蒸干。重复2～3 次以除尽盐酸。
4. DNS-氨基酸的抽提
将上述水解产物, 加0 . 5 ml 水, 用1 mol/ L 盐酸调至pH2～3。加入0 . 5 ml 乙酸乙酯抽提, 分层可在细长滴管中进行。重复抽提2～3 次, 将上层抽提液合并于小试管中, 抽去乙酸乙酯,置于干燥器中备用。
5. DNS-氨基酸的层析与检测
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