复杂注射剂之脂质体的表征与解决方案

脂质体粒径控制的重要性

纳米脂质体 (nanoliposomes) 是一种具有类细胞膜磷脂双分子层的纳米囊泡体，因为磷脂层与细胞膜的结构类似，可以与细胞膜融合，从而将药物送入细胞核中。脂质体载体的释药机制，使其不但可以增加药物溶解度，还具有潜在的缓释或靶向特性，广受研发人员的青睐，全球范围内已有 10 余种注射用脂质体产品获批上市。

纳米药物与其他药物一样，必须具有安全性、可控性与有效性，有效性是纳米药物实现疾病治疗的基础。脂质纳米注射剂经给药在体内运转时，需要克服多重生理/病理屏障，才能安全到达靶点发挥治疗作用，在发挥其药效前需要克服血液、组织、细胞和细胞器等多重屏障。^[1]通过调控纳米药物本身的物理化学性质，如纳米药物的大小、形状、表面电荷等，一定程度上能够克服药物递送障碍。^[2]

相比于传统注射剂，脂质体具有靶向作用，可减轻药物的毒副作用，机体器官对不同粒径微粒的阻留能力不同，可通过脂质体注射剂的粒径控制实现药物被动靶向效果。^[3]脂质体粒径小于50nm时一般都能够靶向至脾组织；在50~100nm时能靶向至肝组织；在0.1~0.2μm时能够靶向至肝组织肝巨噬细胞的溶酶体；在7~12μm时可被肺组织细胞摄取；＞12μm时能够被毛细血管上皮细胞摄取进而到达荷瘤组织内；＞15μm时能被肠系膜动脉等血管上皮细胞摄取^[4]。

脂质体的粒径直接影响药物的释放、生物利用度、载药量、靶向性等，在制备时应控制粒子的大小，获得较窄且均匀的粒度分布。

脂质体制备流程概述

在脂质体的制备方法中有多种制备方法，传统的方法如：薄膜水化法、溶剂注入法、逆向蒸发法等。这些方法几乎都是先将脂质溶解在有机溶剂中，然后再去除有机溶剂。另外，也有大量的非传统制备方法用于研究，如超临界流体(supercritical fluid, SCF)、微流体技术、冷冻干燥法。此处，介绍一种脂质体的制备流程，见图1，通过传统方法制备粒径比较大的粗脂质体，在除去有机溶剂后，再通过微射流均质的方式进一步降低粒径及进行整粒；而后通过超滤进行纯化，得到粒径均一、满足使用安全要求的脂质体。脂质体的平均粒径和粒度分布是脂质体药品关键质量特性，显著影响其体内行为。溶解磷脂可能需要用到毒性比较大的有机溶剂，溶剂残留需要符合ICH相关规定，除去可能存在困难。超滤是影响粒径和溶剂残留的关键工艺，也是达到控制的最后一步工艺。^[5]

图1 脂质体制备与表征流程图

脂质体粒度控制

脂质体给药系统属于非均相热力学不稳定系统，脂质体在制备过程中，若粒径大小及分布不合格，则会影响产品 后续质量问题。粗脂质粒需要经过高压均质或微射流进行整粒，而后进行超滤纯化，得到粒径均一的脂质体。高压微 射流均质机具有大规模、连续化生产等特点，通过高速撞击、剪切与空穴作用达到均质与细化的目的，现已有用于制 备阿糖苷、中链脂肪酸、茶多酚及维生素C等纳米脂质体的实例。[6]

平均粒径与Zeta电位检测

脂质体理化性质评价通常包括粒径大小及分布均匀程度、稳定性及包封率等方面。粒径大小及分布除与其包封率及稳定性有关外，同时对载药脂质体的治疗效果有直接的影响。因物理和生理作用，机体能够选择性地在肝、脾、肺、淋巴等部位聚集不同大小的载药脂质体，从而使其释放药物发挥药效。^[7]此外，还可以通过检测Zeta电位对脂质体稳定性进行评价，Zeta电位越高，体系更加稳定。

NICOMP3000系列用于脂质体粒径检测案例

采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipidfilm hydration（脂膜水化反法）方式制备脂质体，对过滤 挤出工艺前后样本脂质体用Nicomp 3000设备进行粒度检 测，测试结果如表1所示。

表1 GMV法制备脂质体过滤前后粒径分布图（Gaussian 分布）

由表1可知，没有过滤挤出前Gaussian分布下平均体积径为1237nm；经过0.4μm、0.2μm、0.1μm过滤器过滤挤出3次后，平均体积径为219nm、161nm、101nm；平均粒径明显降低。其Nicomp 分布如表2所示。通过Nicomp分布可真实反映脂质体粒径分布情况，由表2中可知，未挤出脂质体体积粒径Nicomp分布有三个峰；经过0.4μm过滤器挤出后三个峰的粒径均减小，经过0.2μm过滤器过滤之后变为单峰，经过0.1μm过滤器过滤之后获得分布更加窄的单峰。

Before Extrusion	After Extrusion through 0.4μm Filter (3 times)
After Extrusion through 0.2μm Filter (3 times)	After Extrusion through 0.1μm Filter (3 times)

表2 GMV法制备脂质体过滤前后粒径分布图（Nicomp 分布）

对比Gaussian及Nicomp分布结果可知：Gaussian分布可整体反应脂质体粒径分布情况；而Nicomp分布更真实反映脂质体粒径分布。通过Nicomp数据的分析可以更好的帮助脂质体制备工艺的优化，选择合适的处理方式得到想要的粒径范围样本。

尾端大颗粒和小粒子的检测

用作载药功能的脂质体平均粒径一般为亚微米级别或纳米级别，但仍存在微米级别的脂质体粒子，尾端大颗粒的存在往往会吸附小颗粒，影响脂质体的稳定性，分析尾端大粒子浓度和数量可以评价当前配方和工艺的情况并做出相应优化，例如用作佐剂的脂质体一般检测0.8μm~10μm之间的大颗粒分布，以确保工艺的稳定。为确保纳米药物的有效性，还需控制小粒子的浓度，过小的脂质体粒子容易被肾脏清除到尿液排出，无法起到治疗作用。^[8]

AccuSizer系列用于脂质体粒径检测案例  

采用GMV(giant multilamellar vesicle)：Sugar-doped lipid-film hydration（脂膜水化反法）方式制备脂质体，对过滤挤出 工艺前后样本脂质体用AccuSizer A7000设备进行粒度检测，测试结果如表3所示。

表3 GMV法制备脂质体过滤挤出后粒径分布图

由表3可知，上面蓝色谱图为数量粒径分布结果，下面红色谱图为体积粒径分布测试结果。分别对制备的脂质体样品用 10μm、5μm、3μm过滤器过滤，经过10μm、5μm、3μm过滤器的数量粒径分布比未过滤前浓度更低，但数量粒径分布 差异不大；观察体积粒径分布，可知：经过10μm、5μm过滤器过滤后，体积占比中大于等于10μm颗粒明显减少；经过 3μm过滤器过滤后，10μm颗粒体积占比进一步减少，且主峰已不在10μm处，尾端大颗粒明显减少。

稳定性分析检测  

稳定性是评估药物的常规项，脂质体稳定性影响存放时间和有效期，稳定性较差的脂质体会导致药物疗效降低或副作用增加，有的药物甚至产生有毒物质。控制尾端大粒子数量和浓度能有效提高脂质体的稳定性，此外，粒径分布较窄的脂质体稳定性也较好。

过滤

粗脂质体经高压微射流等设备整粒之后，需经过超滤才能得到最终的脂质体成品。超滤是以压力为推动力的膜分离技术之一，优点是没有相转移，无需添加任何强烈化学物质，可以在低温下操作，过滤速率较快，便于做无菌处理等。超滤技术的关键是滤膜，滤膜有各种不同的类型和规格，综合考量物理拦截，吸附拦截等效果，选择适配的滤膜材质用于过滤。

参考资料：  

[1] 张灿.聚焦纳米治疗药物的成药性[J].药学进展,2018,42(11):801-803

[2] 王宇馨. 磷酸锰矿化纳米药物及其抑癌作用研究[D].浙江理工大学,2022.

[3] 高谐,丁杨,周建平.脂质纳米注射剂的研究与应用前景[J].中国医药工业杂志,2019,50(10):1098-1112.

[4] 王富喜,邓宏图,王滨.靶向脂质体的药理学评价[J].现代医药卫生,2023,39(01):137-140.

[5] 脂质体关键工艺之挤出和超滤

[6] 陈琼玲,刘红芝,刘丽,王强.高压微射流法制备白藜芦醇纳米脂质体[J].核农学报,2015,29(05):916-924.

[7] 王富喜,邓宏图,王滨.靶向脂质体的药理学评价[J].现代医药卫生,2023,39(01):137-140.

[8] Fukumura D, Kloepper J, Amoozgar Z, et al. Enhancing cancer immunotherapy using antiangiogenics: opportunities and  challenges[J]. Nature Reviews Clinical Oncology, 2018, 15(5):325-340