在纯化过程中,Flash色谱法通常使用 UV 检测器作为检测化合物的主要方法。虽然紫外吸收广泛适用于很多类别的化合物,但它对混合物中的单个化合物的特异性有限,并且无法检测无紫外吸收的化合物。
通过建立质谱-制备联用的实验方法,实现质谱定向馏分收集,帮助用户解决无紫外吸收化合物的分离纯化,从而简化整个纯化过程。本应用案例介绍了在快速制备色谱过程中通过 MS 定向馏分收集,并从姜黄素类化合物中分离天然产物的方法。为确认方法准确性,分离的化合物将通过大气压直接进样分析探头( ASAP )质谱进一步确认。
图1 puriFlash® 5.250 纯化系统 & expression® CMS小型台式质谱仪 & puriFlash® Active Splitter 质谱接口
01 姜黄素类化合物介绍
姜黄素是姜黄根(Curcuma longa)中发现的主要姜黄素类物质。它通常被用作膳食补充剂和化妆品的成分,在烹饪菜肴中调味,以及黄橙色的食用色素。据报道,姜黄素具有抗氧化和抗炎症活性。
在姜黄根 (Curcuma longa) 中发现了三种主要的姜黄素:姜黄素 (I)、二甲氧基姜黄素 (II) 和双去甲氧基姜黄素 (III)。将姜黄粉 (57.3 g) 溶解到 500 mL 乙醇中,然后通过滤纸过滤并浓缩,得到 6.4 g 姜黄素的粗提物。TLC 板信息显示二氯甲烷:甲醇( 97:3)是最佳分离条件。
图2 姜黄提取物信息
02 TLC 方法开发
首先在 TLC 板上分析姜黄提取物,然后将方法转移到 puriFlash® 5.250 纯化系统。在 254 nm 处检测到四种化合物,在 427 nm 处检测到三种类姜黄素,但是,结果显示,UV 检测对单个化合物没有特异性(图3)。
图3 姜黄提取物(97:3 DCM:MeOH)在 365 nm 条件下的 TLC 分析以及 puriFlash® 5.250 的色谱图
03 实验方法-TLC-Flash方法转移
TLC-Flash 进行方法转移:在 Interchim puriFlash 5.250 上进行粗提物纯化(球形硅胶柱 (PF-15SIHC-F0012))。将 32 mg 的粗提物与 250 mg 硅胶混合并装入 4 g Dry-load 柱中 (PF-DLE-F004)。在APCI 离子源负离子模式下,通过 XIC 模式监测收集每种目标化合物的馏分。
图4 通过puriFlash®系统上的InterSoft®X软件进行质谱仪参数设置
04 质谱导向馏分收集结果
三种姜黄素的色谱图及质谱提取离子流图(XIC)。
图5 姜黄提取物(97:3 DCM:MeOH)的 TLC 分析及转移至 puriFlash® 5.250 的色谱图
图6 InterSoft®X软件显示质谱图信息
05 ASAP-MS 直接进样,进行馏分进一步确认
使用ASAP® 大气压直接进样分析探头对组分(1.1,1.2,以及1.3和1.4)进行分析。检测到的质量与理论 [M-H]- m/z值一致。
图7 ASAP-MS 确认分离化合物质谱图信息
结论
•天然产物分离的挑战之一是复杂提取物混合物中感兴趣的化合物的识别。使用质谱和色谱串联,我们可以分离和鉴定复杂混合物中的化合物,纯度和准确性高,不需要进一步鉴定收集的馏分。
•收集的馏分可以通过 puriFlash® 制备系统上的 InterSoft® X 软件提供的 MS 数据直接进行鉴定。
•puriFlash® 5.250 和 expression® CMS 为纯化和鉴定天然产物提供了更快捷更灵活的检测和收集方法。
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