影响ELISA实验的因素和对策
在ELISA 操作中,洗涤是最主要的关键技术,操作时尤为注意:
保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板後最好在吸水纸或毛巾(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干(若使用易掉渣的纸,纸屑会留在板孔中,由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。);
注意各种试剂盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀释,应按要求稀释,所用的水电导率最好在1.5us/cm 之下,洗液如果结晶应待其融解後配制。
保证洗板浸泡时间为40 秒左右,孔内液体被洗板机吸收得越干净洗涤效果更好,手工洗板防止洗液在孔内形成气泡。
合理安排,或多用几台洗板机。
在间接法中如本底较高,可增加洗涤次数或延长浸泡时间。
参考ELISA#洗涤
显 色:
结果不好的可能原因
显色剂配制後放置时间过长或使用过期显色剂;
加显色剂时溅出孔外造成液体回流。
解决方法:
显色剂尽量在临用前配制,坚持不用过期显色剂,肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用;
加样时保持显色剂不外流,且加样量要准确,顺序不能颠倒。
A、B液应避免接触金属器械。
可以参考ELISA#显色和比色
终 止:
结果不好的可能原因:
加终止液时产生较多气泡,导致假阳性增加。 解决方法:
加终止液时应避免产生气泡,及时终止显色。
读 板:
结果不好的可能原因:
读板时板底底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面。
应保证酶标板清洁。
此外酶标仪不应安置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15~30℃,使用前先预热仪器15-30 分钟,测读结果更稳定。