Pippin系列全自动DNA片段回收仪用于外泌体small RNA研究

环亚生物

2023/12/05 17:36

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背景知识：

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EV）是由细胞释放到胞外的脂质双分子层包裹的微小囊泡。近年来，研究者对血液样本中EV分析越来越感兴趣，主要源于细胞分泌的EV携带多种物质如核酸，蛋白质，脂质等，可以作为生物标志物表征病理生理过程。由于血液成分的复杂性阻碍了EV的准确检测，从而减缓了其在临床应用中的发展。目前已有多个研究证明，不同EV回收方法得到的不同回收效率和纯度的EV，会影响血液样本中基于EV的生物标志物分析。虽然研究人员在尝试理清整个EV检测流程中，包括血液采集管（BCT）的类型以及血液处理间隔（BPI）（即血液采集和处理之间的时间）等因素，但真实情况仍未明确。另外，没有适当且可量化的指标用于帮助选择最适合研究目标的BCT和BPI。因此，建立和验证BCT和BPI的标准操作程序（SOP）至关重要，这也是建立可靠临床相关的生物库的先决条件，以及EV相关生物标志物发现和验证的前提条件。

2023年3月，比利时根特大学Bert Dhondt等在《Journal Of Extracellular Vesicles》杂志上发表了题为：Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics的研究论文。作者详细评估了11种BCT对9项性能指标的影响，包括血样质量、EV稳定性、EV血细胞来源和EV相关蛋白质组和小RNA转录组特征等，并对三个临床相关样本的BPI进行了额外评估（如图1）。

图1. EV血液标准（EVBB）研究实验设计

实验方法：

从健康人和癌症患者处获取血液样本，经血液指标分析与溶血分析后，合格血液样本进入后续实验。通过已有的分离方案，结合体积排除色谱（size-exclusion chromatography, SEC）和Optiprep密度梯度超速离心（ODG），从血清和血小板贫化血浆（Platelet depleted plasma, PDP）样品中分离EV。继而对分离获得的EV进行物理表征，涉及尺寸和形态，同时液相色谱-串联质谱法和二代测序等对EV进行蛋白组和转录组信息表征。其中 small RNA的文库制备，由sage science公司的 Pippin系列全自动DNA片段回收仪结合3% agarose预制胶，精准回收125-153 bp范围的small RNA，去除杂带，使得测序结果聚焦目标small RNA，清晰展现EV的small RNA图谱。

在本文中，作者进行了第一次大规模EV血液标准（EV Blood Benchmarking , EVBB）研究，全面比较了BCT（n=11）和BPI（n=3）对EV分析的影响，目的是建立优化血液EV分析程序，开发并实施反映样本质量、EV回收率、血细胞衍生EV亚型的离体释放以及EV相关分子特征的性能指标。基于这些发现，本文为研究人员提供了一般性建议，即根据情况选择相应的BCT和BPI（图2）。综上说述EVBB研究有助于血液EV研究方法的标准化提供性能指标，作为新开发的BCT、额外BPI以及其他因素分析的框架，并支持EV研究方法的进一步标准化。

图2. 选择BCT和BPI进行血液EV分析的一般考虑因素

引用文献：

Dhondt, Bert, et al. "Benchmarking blood collection tubes and processing intervals for extracellular vesicle performance metrics." Journal of Extracellular Vesicles 12.5 (2023): e12315.