BluePippin+LRS揭示转录起始位点调控mRNA亚型的机制

Cell顶级期刊：BluePippin+LRS（Long-read sequencing）揭示转录起始位点调控mRNA亚型的机制

近日，来自德国马普研究所的Valerie Hilgers团队在顶级期刊《Cell》上上发表了题为Sites of transcription initiation drive mRNA isoform selection的文章，揭示了在mRNA可变剪接过程中，转录起始位点（TSSs）通过表观遗传方法调控多聚腺苷酸位点（PASs）的详细分子机制。

• 背景知识：

在mRNA合成过程中，任何一步出现变异都会影响成熟转录本的编码区和非编码区。可变剪接（AS）和选择性多聚腺苷酸化（APA）可以产生不同编码区（CDS）或者不同长度3'端非编码区（3'UTR）的mRNA。可变3'UTR区通过调控相关microRNA转录本和RNA结合蛋白（RBPs）互作的序列和结构元件，继而调控编码蛋白的丰度、定位以及蛋白复合体的组装。而APA则依据环境不同、基因不同以及细胞类型不同来调节蛋白功能。APA参与多种细胞过程，广泛影响细胞功能。研究发现，肿瘤和神经紊乱在内的许多人类疾病都与APA失调有关。

APA的组织或环境特异性调控，是通过转录因子或RBPs等效应物的活性所介导的。在不同细胞环境下，转录延伸因子和转录终止因子与可变剪切和多聚腺苷酸化（CPA, the cleavage and polyadenylation）机制的相互作用，可以增强或抑制mRNA 3'端的加工。然而，APA的基因特异性调控机制尚不清晰，虽然已有多项研究表明启动子的转录调控可能与APA相关联，但是转录起始位点（TSS）是否会影响poly(A) 位点（PASs）的选择仍然未知。研究人员期待更多方法帮助挖掘转录起始、可变剪接、APA、3'UTR区之间的调控关系。

上述关于转录起始、剪接和终止位点选择的调控机制研究，面临的主要挑战是如何将单个转录本的不同区域相互关联。特别是同一mRNA中相距几千碱基的5'端和3'端。到目前，该领域仍没有能够确定单个转录本的完整起始和终止位点、并完成测序的方法。这阻碍了对转录起始和终止之间调控关系的系统分析。而传统LRS测序文库片段通常分布在1-2 kb，其获得的mRNA亚型长短不一且不具代表性，还会存在5'或3'端的碱基偏差。由于无法获取完整的全长 mRNA 亚型，也就无法量化同一基因的不同 TSS 对3'端序列的影响。

• 实验方法：
  

本研究中，结合Sage Science公司BluePippin全自动DNA片段回收仪，开发了一个研究策略Combined Isoform Assembly（CIA）来准确评估和量化长或者超长mRNA异构体，显著提升mRNA亚型发掘效率和质量（图1）。以果蝇大脑组织（具有丰富的mRNA多样性以及超长mRNA）为例，使用BluePippin富集＞3kb的DNA片段，显著提升read长度（图2），从而提升read的完整转录本覆盖率（图3、4）。

图1 mRNA亚型组装流程

图2. 使用BluePippin 进行片段选择后显著增加了ONT cDNA的read长度（A），并优化了神经元转录本的回收，其长度（B）超过了没有进行片段选择的LRS实验的覆盖范围（灰色）

图3. 不同组织使用不同LRS测序获得read长度分布情况。BluePippin片段选择后（下图中的红色图表）显著提高了全长转录本的覆盖率

图4. 在片段筛选之前（上图）和之后（下图），果蝇头部的纳米孔测序cDNA和PacBio Iso-seq的每个read的全长转录本覆盖率，筛选后有显著提升（对于每个read，显示所覆盖的目标转录本的分数；根据目标转录本的长度对读数进行分组）

从分析结果来看，通过 BluePippin片段筛选后，获得的转录本3'端碱基分布更具真实性，没有过多的A碱基背景噪音（图5A）。且获得的转录本长度/数量远高于先前注释的转录本（图5B）。借助BluePippin全自动片段回收仪，CIA策略生成了果蝇mRNA亚型图谱，产生了59970个高置信度的全长转录本，其中包含多个新的mRNA亚型，显著提升mRNA亚型发掘效率和质量。

图5.（A）被丢弃3'端碱基序列与CIA方法获取3'端碱基序列比较（B）随着获取转录本长度增加，新转录本数量也急剧攀升

• 实验结果：

在不同的细胞中，通常是通过可变剪切产生不同的mRNA亚型来调节基因的表达和功能。本研究评估了转录起始、可变剪切和3'末端位点选择之间的调控关系。借助长读长测序（LRS）精确获取超长转录本的两端序列，明确果蝇组织中的mRNA亚型数量，特别是转录情况复杂的神经系统。研究发现，在果蝇头部以及人类大脑器官中，转录起始位点(TSS)广泛影响3'末端位点的形成。“显性启动子”具有特定的表观遗传特征如p300/CBP结合，其通过施加转录限制来决定剪接和多聚腺苷化类型。体内“显性启动子”缺失或过表达以及p300/CBP的缺失，都会改变了3'末端的序列。研究表明，TSS的选择对转录本多样性和组织特性的调控具有重要影响。

• 文献原文阅读：

Alfonso-Gonzalez, Carlos, et al. "Sites of transcription initiation drive mRNA isoform selection." Cell 186.11 (2023): 2438-2455.

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