新一代快速流式细胞仪Moxi GO II，助力单细胞测序

单细胞测序技术首次问世于2009年，十几年来不断完善和发展，尤其在近几年出现爆发式突破和应用普及。不同于传统的多细胞层面，单细胞测序技术聚焦于单个细胞，是对单个细胞在基因组、转录组、表观基因组及蛋白组等水平进行测序分析的技术，反映了细胞间的异质性。此外，单细胞平台一次性可以分离、分析几千个单细胞，有助于分类或定义新的细胞类型。单细胞测序技术的发展和更新，为研究解析单个细胞的行为、机制、与机体的关系等提供了方向，为早期检测、诊断疾病及疾病个体化治疗提供指导。

与传统测序相比，单细胞测序技术更为困难和复杂，存在样本量小、RNA降解快、噪声和批次效应等问题，需要特殊的实验设计、数据处理和分析方法，每次实验都会耗费大量的时间、费用以及无形的机会成本。因此单细胞测序平台都非常强调样品制备的重要性，包括精确测量细胞浓度、活率以及确定样本组成等，这些参数决定了下游实验的成败。

• Moxi GO II快速流式细胞仪

美国Orflo Technologies公司将行业公认的细胞计数金标准——库尔特原理（Coulter Principle），与荧光流式检测技术相结合，推出的新一代快速流式细胞仪——Moxi GO II，提供超准确的细胞计数、细胞活率检测，以及超高分辨率的细胞粒径测量，可用于评估样本纯度、准确的细胞核计数和细胞表型分析，非常适用于单细胞测序中细胞样本制备的质控。

图1. Mxoi GO II

• 何为库尔特原理？

细胞/颗粒和缓冲液导电性不同，在恒定电流设计的电路中，悬浮在缓冲液中的颗粒/细胞随缓冲液通过小孔管时，取代相同体积的缓冲液，从而导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。

图2. 库尔特原理视频，请点击图片链接

库尔特原理对颗粒个体进行逐个三维测量，不但能准确测量颗粒的粒径分布，更能进行粒子绝对数目和浓度的测量。由于检测时不受激光衍射、散射因样本颜色或浓度变化的影响，库尔特原理所测粒径大小更接近真实。

• Moxi Go II的性能

• 卓越的细胞计数和活率检测能力

采用库尔特原理的Moxi GO II系统可对样本中的细胞进行逐个计数和体积测量，几秒钟内计数多达40000个细胞，数据统计的准确性和可靠性远高于成像类细胞计数仪（每次只检测几百个细胞）。此外，Moxi GO II还配备了488nm激光激发光源及两个PMT荧光检测通道，能够进行基于碘化丙啶（PI）荧光染料的细胞活率检测，其检测灵敏度、准确度与流式细胞仪相当，远高于成像类细胞计数仪（如图3所示）。Moxi GO II细胞计数和活率测量结果的准确性和一致性，为单细胞测序中细胞样本的质控提供了可靠依据。

图3. 不同检测系统的计数和活率检测CV值

• 无与伦比的粒径分辨率

成像类细胞计数仪基于2D图像分析，通过软件算法识别细胞边界以确定细胞直径，这种方法依赖成像效果，不确定因素多，易出现“误判”，如将碎片识别为细胞等。Moxi GO II根据库尔特原理，采用的是3D立体测量，获得更为真实的细胞大小信息，提供高分辨率的细胞粒径分布图。如图4所示，将5种不同大小的微珠（4.1μm，6μm，7.9μm，10.1μm，和 16μm）混样，分别用Moxi GO II和成像类细胞计数仪检测，结果发现，Moxi GO II能够很好的区分5个峰，而成像类设备只能区分两个峰，前面的4个峰无法区分开来（图4红框内）。

提高粒径分辨率能为研究者提供细胞状态的评判参考，保证单细胞测序实验顺利进行。如图5所示，研究者用Moxi GO II内置的结果叠加比较功能，将“健康”Jurkat细胞（绿色曲线）与缺氧、室温环境下处理的“不健康”Jurkat细胞（灰色曲线），进行粒径分布比较，发现二者粒径分布差别较大。“不健康”细胞小颗粒（此实验中4-9μm）数量明显增加，总平均细胞粒径减少（图5 红框内），这些变化可能与细胞破碎有关。不健康的样品含有细胞破碎产生的游离DNA/RNA，会干扰和影响测序结果，所以根据该粒径信息可快速选择符合要求的细胞样品。

图6. 聚集和非聚集样本结果叠加比较

高分辨率的直方图结果，也可用于评估细胞样本的聚集程度，研究者可据此评估是否需要在后续操作之前对样本进行调整。单细胞测序技术要求样本为单细胞悬液，以确保每个油滴中仅捕获一个细胞。细胞聚集状态会对下游实验造成重要影响。如图6所示，在Moxi GO II系统中，将聚集的HEK-293细胞结果直方图（灰色曲线）与单分散的单细胞样本结果直方图（绿色曲线）叠加比较，发现灰色曲线不仅峰值分布的偏斜（长尾）的显著增加，而且还显示了模态峰值的增加，因为样本主要由多峰（细胞簇）组成。

• 样品纯度评估指标

在单细胞测序技术样本制备过程中，关键部分是将单个细胞包裹进油包水的微液滴中。

因此，当研究人员研究特定类型细胞时，尽可能最大限度提高含有该类型细胞的液滴比例。Moxi GO II可通过粒径和荧光测量来评估样品纯度，如图7所示。图中红色直方图是粒径分布图叠加。研究者可通过粒径门控计算RBC“污染”程度（黄色箭头所指为RBC峰），还可通过荧光标记，进行第二维度的纯度检测（黄色框内是通过PE-CD45（HI30）抗体标记的白细胞）。

单细胞测序技术常用磁珠来纯化细胞。图8展示了初始PBMC样本（灰色曲线）与磁珠分离后的单核细胞（绿色曲线）粒径直方图比较，分离后，去掉了较小的淋巴细胞峰。Moxi GO II高分辨率粒径测量为研究者带了便利，可通过无标记的粒径分布来验证样品纯度。

• 精确的细胞核计数

单细胞测序技术中，当样本为细胞核，需要对其进行精确计数和测量。由于细胞核体积较小（直径通常为4-9μm），成像类细胞计数仪难以提供可靠的结果。而Moxi GO II可分辨低至3μm的颗粒，对细胞核进行快速可靠的计数。同时，还可通过PI染色，增加细胞核分辨率。如图9所示，图9a为完整PBMC细胞检测结果（活率vs粒径散点图），图9b为裂解后细胞核检测结果，计数结果相同（1.23e5/ml）。分离的细胞核样本粒径减少，荧光信号增强，符合预期。

图9. 细胞核计数

• 细胞表型分析

单细胞测序中，使用细胞表面免疫标记进行表型分析，即用于基因组分析之前简单地确认或鉴定细胞组成（例如，PBMC样品中CD8阳性T细胞的百分比），也可以用于样品纯度检测（例如，在T细胞分选或磁珠分离后使用CD3来确定T细胞纯度）。Moxi GO II具有488nm激光器和两个PMT，可同时检测两个荧光团（例如FITC和PE），进行精确的计数和粒径测量。如图10所示，具有FITC抗人CD8（HIT8a，BioLegend）和PE抗人CD3（OKT3，BioLegend）的双重标记。使用Moxi GO II象限门控可轻松圈定阳性与阴性群体的荧光，使研究人员能够区分细胞群体。对于分选后的纯度检测，第一PMT/通道（525/45nm）可用于纯化细胞的独特抗体标记。第二通道646nm/LP可用于测量PI染色（活率）。通过这种设置，研究者一次测试，可获得了多个质控信息：表型纯度、尺寸分布（例如聚类）、浓度和活力。

图10. 细胞表型分析

• 总结：

单细胞测序技术独特复杂，成本昂贵，因此样本处理制备就显得尤为重要，是下游实验成败的基础。Orflo的Moxi GO II系统非常适用于细胞样本的全程监测。 Moxi GO II采用库尔特原理进行细胞计数和粒径测量，同时采用488nm激光光源，结合两个PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根据需要更换），进行细胞活率、细胞凋亡、转染效率、活性氧簇、线粒体膜电位等常规流式检测。

仪器设计小巧轻便，无需预热，开机即用，预设程序，触屏操控，运行后10秒即可给出测试结果，使用后也无需清洁维护。Moxi GO II功能多样，简单易用，为广大研究者提供了一个非常实用的检测工具。通过Moxi GO II，无论是经验丰富的流式专家，还是初试身手的实验小白，都可以轻松完成实验。

美国Orflo Technologies公司是一家非常专业的细胞分析仪器研发和制造企业，拥有多项专利技术，产品以库尔特原理的高精细胞计数仪和超快流式细胞仪为主。作为中国地区独家代理，环亚生物科技有限公司全权负责Orflo Technologies产品在中国地区的推广、销售，为广大用户提供专业的技术咨询和产品服务。

环亚生物，生命科学产品全国性代理商，不断把国外顶级的创新产品引入中国。环亚生物具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。

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