解锁单细胞小RNA测序新“姿势

— Pippin Prep助力单细胞小RNA测序
Small RNA是一类长度在20～30nt的RNA分子，Small RNA种类较多，研究比较成熟的主要有siRNA（小干扰RNA）和microRNA（微小RNA）。还有其他一些种类的小RNA，如piRNA（蛋白互作小RNA），snRNA（小核RNA），snoRNA（核仁小RNA）等。Small RNA能够调控基因的表达，在细胞的生长、发育、代谢等基础生物学过程中扮演着重要的角色，甚至在癌症等相关疾病形成过程中起着关键的作用。小RNA测序鉴定和定量解析已知的小RNA，并预测新的小RNA及预测小RNA的靶基因，是研究小RNA的功能和调控机制的有力工具。

Michael Hagemann-Jensen, et.al于2018年9月在《Nature Protocols》上发表的文章（原文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-018-0049-y）中提出了异于传统小RNA测序的单细胞小RNA测序技术—Small-seq技术。Small-seq技术是指对单个细胞的小RNA进行测序，是一种基于接头反应，集捕获、测序以及小RNA分子定量分析于一体的对单个哺乳动物细胞进行测序的方法。该方法的大致流程如下：

 
其中步骤11提到的片段选择，是Small-seq技术非常推荐的一个步骤，该步骤不仅可以富集所需要的目标片段，同时还可以高效地去除引物二聚体等影响后续测序实验的非靶向片段。该步骤推荐使用Sage Science公司的PippinPrep进行片段选择。其具体实验设计如下：
（一）实验材料：制备好的小RNA文库
（二）实验试剂：
Pippingel cassette，3% agarose（Sage Science, cat. no. PIP0001）
Pippin Prep Reagent Kit for 3% gel cassettes (Sage Science, cat. no. CSD3010）
（三）实验仪器：PippinPrep（Sage Science）
（四）实验步骤：
1. 片段选择参数设置：选择“3%DF Marker P”，选择“Tight”纯化模式，起始
和终止片段大小分别设置为130bp和160bp。
2. 从小RNA文库中吸取30ul的DNA与10ul的DNA Marker P 振荡混匀。
3. 上样：将40ul混合液加至3%的预制胶板上样孔中。
4. 运行程序。程序结束后，从洗提孔中吸出40ul 回收产物。
5. 取1ul 回收产物用Agilent 2100 进行片段分布分析。
Note：整个过程用时约2小时，手工操作时间仅5min。
（五）实验结果

 

 

由上图可知，PippinPrep在small RNA测序过程中，可以对构建好的小RNA文库进行纯化，可减少实验过程中引入的引物二聚体，更有利于下一步的测序实验。使用PippinPrep进行片段回收，不仅操作简单、耗时短，而且回收范围窄，所获得的目标片段纯度更高。

美国Sage Science公司推出的全自动片段回收类产品除了PippinPrep，还有分离片段大小和通量不同的其他型号，其中Blue Pippin、PippinHT都可以对构建好的小RNA文库进行纯化。

有关Sage Science：
美国Sage Science公司位于美国马塞诸塞州Beverly市，专注于核酸和蛋白领域的样品制备。Pippin系列核酸片段自动回收设备已成为测序实验室标准配置，并享有产品和技术专利。现已开发出五款产品：Pippinn Prep、Blue Pippin、Sage ELF、PippinHT、Sage HLS，满足不同类别的客户需求，广受市场欢迎。

Pippin系列基于先进的技术原理进行DNA片段回收：Pippin系统包括一次性的5泳道预制胶电泳槽，一个带有DNA荧光检测光路单元（非紫外）的电泳平台。运行中，软件通过实时光路检测，和参考泳道中的DNA ladder进行比对，确定已经设置回收长度范围的DNA片段到达洗提泳道（elution channel）的准确时间。通过电极切换，打开洗提泳道，使目标片段进入洗提泳道的回收室中，从而实现回收。然后电极再次切换，洗提泳道关闭，剩余的DNA分子进入原先的分离泳道（separation channel）。
 
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