葡聚糖T-10 Pharmacia17-0250-01
葡聚糖凝胶是通过表氯醇交联多个葡聚糖得到的。葡聚糖凝胶 G-10、G-25这些葡聚糖凝胶是在水溶液中使用,若要用有机溶剂做为流动相。只有通过羟丙基化将葡聚糖凝胶 G转化为可在有机溶剂中溶胀的葡聚糖凝胶。这时的产品为葡聚糖凝胶 LH-20或LH-60。
金属螯合亲和层析介质,又称固定金属离子亲和色谱,其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+,Zn2+,Ni2+,Co2+,Fe3+发生特殊的相互作用,能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质,从而达到分离纯化的目的。因此,偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合,但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。
镍NTA亲和层析介质(Ni-NTA )具有特异性好、流速快的优点,颗粒粒度均匀,粒径小,并且螯合镍更稳定,能耐受更高的还原剂,物理和化学稳定性好,批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子,使用更方便。
葡聚糖凝胶 LH-20的分离原理主要有两方面:以凝胶过滤作用为主,兼具反相分配的作用(在反相溶剂中)。因为凝胶过滤作用,所以大分子的化合物保留弱,先被洗脱下来,小分子的化合物保留强,最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱,葡聚糖凝胶 LH-20对化合物还起反相分配的作用,所以极性大的化合物保留弱,先被洗脱下来,极性小的化合物保留强,后出柱。如果使用正相溶剂洗脱,这主要靠凝胶过滤作用来分离。
葡聚糖T-10 Pharmacia17-0250-01
使用方法
1. 乙醇浸泡:
在室温下,将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时,并不断搅拌以保证凝胶溶胀,用无盐水洗去残存的乙醇滤干;
2.无盐水浸泡:
室温下,在无盐水中充分溶胀24小时,间隙搅拌,以保证凝胶的完全溶胀,然后;
3. 盐酸浸泡:
在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时,间隙搅拌,滤干,水洗至中性;
4. 将溶胀好的凝胶脱气后(真空抽滤或超声波)根据装柱要求一次性置入柱内,注意保持湿态装柱,并避免柱内产生气泡或断层;
5. 上样前平衡层析柱至少3-5 个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer 的PH值);
6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积,我们建议初次上样控制在1-2%的床体积,视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20% 的柱床体积,柱高的选择也与分离要求相关,柱高控制在40-50cm 以下,过高的凝胶层会引起较大的反压,应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制,脱盐时高径比为5:1 即可;
7. 洗脱方法:
可以用无盐水,也可以采用上柱时的缓冲液洗脱;在上柱Buffer 中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化;
8. 在位清洗(CIP)
凝胶使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h 用1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积,再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。