AFLP分子标记技术及其应用

2016-04-25 07:14

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目前遗传标记主要有4种类型，即形态标记(Morphological markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Mo1ecular Markers) 。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证，结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致，充分证明了AFLP技术原理的可靠性。进行AFLP分析时，一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切，一种为低频剪切酶，识别位点为六碱基的rare cutter；另一种为高频剪切酶，识别位点为四碱基的frequent cutter。双酶切产生的DNA片段长度一般小于500bp，在AFLP反应中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个识别位点的EcoR I。 AFLP接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。接头(Artificial adapter)一般长14～18个碱基对，由一个核心序列(Core sequence)和一个酶专化序列(enzyme-specific sequence)组成。常用的多为EcoR I和Mse I接头，接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。AFLP引物包括三部分：5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3′端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension，EXT)。 1.2. AFLP分子标记技术流程 AFLP分子标记技术包括3个步骤：(Ⅰ)DNA的准备。即DNA的酶切以及与人工合成的寡聚核甘酸接头(artificial oligonucleotide adapter)连接。为了使酶切片段大小分布均匀，一般采用双酶酶切，在基因组上分别产生低频切口和高频切口。(Ⅱ)选择性扩增酶切片段。AFLP引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性内切酶识别序列(ENZ)和3′端选择性碱基三部分。一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增，然后用带2～3个选择性碱基的引物进行再扩增。所用引物可用放射性或荧光标记。(Ⅲ)AFLP标记的统计。AFLP产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳(SDS—PAGE)检测样品的多态性，可灵敏地分辨只有一个碱基差异的不同DNA片段。[6](图1)

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