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引物(primers)设计知识介绍

2016-01-05 07:26

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引物(primers) 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列,一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补,另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 引物的重要性 在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合,不与其他非目的DNA结合,PCR的灵敏性要求dna聚合酶能对引物进行有效的延伸,可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。 引物设计原则 1.引物长度 引物长度 一般为15-30个核苷酸,在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物,但最多不超过50个核苷酸。 2.碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低,使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 3.引物Tm值 一般要求:55℃-65℃。 计算: 对于低于20个碱基的引物,Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物,Tm值则需要考虑热动力学参数,从“最近邻位”的计算方式得到,这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15   4.引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补 发夹结构 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构,否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。 5.引物3’端 引物的延伸从3’端开始,因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对,不能进行任何修饰,否则不能进行有效的延伸,甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性,引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。

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