RNA快速提取一步法的建立

2015-10-19 08:46

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RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分，不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示（mRNA differential display）、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交（suppression Subtraction Hybridization, SSH）、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA。因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题。1987年Chomczynski等［1］建立了酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法（acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC）。该方法较以往的传统方法操作简单，无需特殊的设备，抽提时间缩短至4 h，因而得到广泛的应用。数家公司据此开发出rna提取试剂盒［2，3］。使用试剂盒简单方便，但价格相对昂贵。为探索操作简便、经济实用、快速有效的RNA提取方法，我们分析了大量相关文献资料，进行了多次实验，成功地研制出一种新型的RNA提取试剂，建立了其操作程序，我们称之为RNA快速提取一步法。其性能达到进口试剂盒的水平，但造价低廉、操作简便，特别适用于国内实验室。 1　材料与方法 1.1　试剂　　变性液（4 mol.L－1异硫氰酸胍，25 mmol.L－1柠檬酸钠pH 7.0，5 g.L－1十二烷基肌氨酸钠,0.1 mol.L－1β－巯基乙醇），按文献［1］方法配制；2 mol.L－1的乙酸钠；重蒸酚；氯仿；异丙醇；8－羟基喹啉；柠檬酸；柠檬酸钠；乙酸；乙酸钠；800 ml.L－1乙醇；RNAzol试剂盒(Promega 公司)；Trireagent (Sigma 公司)。 1.2　仪器　　电泳仪、岛津UV-160型紫外可见分光光度计（日本产）、超声匀浆仪（美国Sonics Material Inc. Jencons产品）、玻璃匀浆器。所用器皿均按RNA提取的一般要求进行处理［4］。 1.3　标本　　大鼠脑组织、脊髓组织、培养细胞。 1.4　RNA快速提取试剂的制备 1.4.1　酸酚的平衡　取重蒸酚于65℃水浴融化, 加入1 g.L－18-羟基喹啉；用50 mmol.L－1乙酸钠（pH 4.0）平衡。在平衡的过程中不断搅拌，并反复更换乙酸钠，待上清液相的pH值达到4.1为止。 1.4.2　CSB缓冲液的配制　用DEPC处理过的纯水配制CSB缓冲液，由42 mmol.L－1柠檬酸钠、8.3 g.L－1十二烷基肌氨酸钠和0.1 mol.L－1β-巯基乙醇组成。 1.4.3　快速RNA提取试剂的配制　用CSB缓冲液配制4 mol.L－1异硫氰酸胍；加入0.1体积4 mol.L－1乙酸钠（pH4.0）, 加入等体积酸酚，0.02体积的异戊醇，混匀，即为RNA快速提取试剂。4℃保存备用。 1.5　RNA快速提取程序　　组织RNA的提取：将约10～100 mg的组织块置于匀浆仪中，加入1 ml RNA快速提取试剂，进行匀浆；将匀浆液倾入1.5 ml离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混合20 s；冰上放置5 min；4℃离心12　000 r.min－1, 15 min。离心管中的液体分为3层: 上层为无色透明的无机相，RNA保留于此相中；下层为呈淡黄色的有机相，蛋白质保留于此相中；上下两层的界面处为中间层，DNA保留于此相中。小心吸取上层水相约0.5 ml于新管中，切勿吸取中间层和下层液体，以避免DNA和蛋白质的污染。异丙醇沉淀：加入等体积的－20℃预冷的异丙醇，混匀，4℃离心12　000 r.min－1，15 min, 弃上清；用0.5 ml预冷的80％(体积分数)乙醇洗涤沉淀，弃尽乙醇，在空气中自然干燥，溶于适量DEPC处理的水中，用于后续的实验或－80℃保存。培养细胞RNA的提取：培养细胞生长至旺盛期，弃掉培养基，用冰冷的PBS缓冲液冲洗两次，直接向细胞中加入1～2 ml RNA快速提取试剂，轻轻晃动培养瓶使细胞与RNA快速提取试剂充分接触，冰上放置5 min，吸出粘稠的细胞裂解混合物于新的离心管中，加入0.1体积的氯仿，振荡混匀。其余步骤与上述组织RNA提取方法相同。传统一步法提取RNA，按文献［1］方法进行；用Trireagent 或RNAzol提取RNA，按试剂盒说明操作。

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