其它链扩增技术及应用范围

2015-09-21 06:56

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资料摘要：

一、免疫PCR 　　所谓免疫（Immune PCR）就是利用抗体与DNA特异结合来检测抗原，把抗原抗体反应与PCR联合应用而建立的一种抗原检测系统。　　在免疫PCR中，一个中介分子同时具有与DNA、抗体分子特异结合的能力。其一端连接DNA（标记物），另一端连接抗原-抗体复合物，形成一个特殊的抗原-抗体-DNA连接物。作为标记物的DNA分子可用PCR的扩增，存在特异的PCR产物应证明作为标记物的DNA分子已特异地与抗原-抗体复合物结合，而且表明了抗原的存在。有人采用SAP（streptavidin – protein A）嵌合体作为中介物。它具有双特异性结合能力，一端为链霉亲和素，可结合生物素；另一端为可与IgG的Fc段结合的蛋白A。这样可特异地把生物素化的DNA分子和抗原-抗体复合物连接在一起。　　选用BSA作抗原进行免疫PCR实验，结果表明，可检测出580个抗原分子（9.6×10-22mol/L），而且可以完全避免其它非特异信号的干扰。与采用碱性磷酸酶的ELISA相比，其灵敏度可提高105倍，较常规的放名分析灵敏度也高出几个数量级。　　免疫PCR产物在普通的琼脂糖电泳上就可以检测出来，如用更好的方法来检测PCR产物，如放射性同位素，荧光物或酶等掺入到PCR产物中，可进一步提高其灵敏度和适用性。另外，如果采用不同大小标准的DNA进行标记，在电泳时，可同时检测出多种不同的抗原分子。　　PCR产物的多少与抗原结合量有关，如果用标准反应作对照，则可以对抗原的量进行估算。因此，通过改变连接物的浓度就可以改变检测系统的灵敏性。其它因素，如抗体的浓度，PCR循环周期数，PCR产物的检测方法等也同样影响系统的灵敏性。　　二、转录依赖的扩增系统（Transcription-based Amplification System , TAS）　　扩增样本中的RNA，一般要先将其逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行pcr扩增，能否将RNA靶序列直接扩增出来呢？Kwok等人发明了TAS来解决这一问题。结合应用葡聚糖珠寡核苷酸杂交技术可进一步提高方法的特异性和效率。其原理是：制备引物A、B，引物A与待检RNA3’端互补，并有一T7RNA多聚酶的识别结合位点。逆转录酶以A为起点合成cDNA；引物B与此cDNA3’端互补，逆转录酶同时还具有RnaseH和DNA多聚酶的活性，又可利用引物B合成cDNA的第二链。RNA多聚酶以此双链cDNA为模板转录出与待检RN-一样的RNA，这些RNA又进入下轮循环。RNA多聚酶从一个模板可以转录出10～103个拷贝，因此反应中待检RNA拷贝数以10的指数方式增加，较PCR高得多。扩增产物用葡聚糖珠夹心杂交法检测：产物先与标记的探针杂交，再与包被在葡聚糖珠上的另一互补寡核苷酸（与标记探针互补的位置不同）杂交、检测。该方法同一般杂交检测技术相比，特异性要高出许多。

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PCR在突变基因检测中的应用

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