荧光原位杂交 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) 是指利用荧光染料标记的,已知序列的单链核酸作为探针,通过碱基互补配对原则,与待检样品中核酸进行特异性结合,然后通过观察荧光信号,从而对样品中待检核酸进行定性,定量及定位分析。FISH 具有快速,信号强,特异性高以及可以多重染色等特点,广泛应用于产前诊断,基因组结构分析等领域。
影响 FISH 结果的因素有很多,包括样品准备和处理,显微镜,光源,荧光探针以及滤光片。FISH 通常基于荧光显微镜来观测信号,所用滤光片包括激发片,二向色镜和发射片三种。其工作原理如下图所示:
激发片:选择透过光源的某部分波段的光,用来激发荧光探针;
二向色镜:反射光源的光至样品,透过产生的荧光并反射激发光的散射光;
发射片: 选择透过荧光的某部分波段的光至检 测器或人眼,并完全阻挡掉激发光的杂散光。
在 FISH 实验中,滤光片带宽的大小会对 FISH 图像的对比度产生重要的影响。增加带宽会提高激发和接收效率,使接收的信号增强。但实际接收的信号中同时包含了探针的荧光信号和样品的背底噪音,带宽的增加会同时增加这两者的强度。带宽减小,虽然可以降低背底噪音的强度,但荧光信号也会随之减弱 。所以对于对比度要求很高的 FISH 实验,针对于每种具体的染料,都会存在一个zui佳的带宽,使 FISH 图像能够达到zui佳的对比度。Chroma的FISH 滤光片的带宽都是根据常用的 FISH 染料做过优化,可以为用户的 FISH 实验提供zui佳的对比度的图像。