线粒体呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途

YIJI线粒体呼吸链复合物II（琥珀酸－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚，通过反应系统测定样品中二氯酚靛酚还原后吸光峰值的变化，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。可用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

线粒体呼吸链复合物II，通常称为琥珀酸－辅酶Q还原酶或琥珀酸脱氢酶（Succinate-Coenzyme Q Reductase；Succinate Dehydrogenase），是线粒体电子传递链与三羧酸循环链接的载体：含有四个亚单位，包括共价结合的辅基黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide；FAD）和三个铁硫中心（Fe-S clusters），以及细胞色素b亚单位，其最特征性的酶活性是丙二酸钠敏感的琥珀酸－辅酶Q还原酶。复合物II催化琥珀酸（succinate）被氧化为富马酸（fumarate），线粒体内电子由供体FAD传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，进行呼吸链传递。该酶异常会导致嗜铬细胞瘤（paraganglioma）、肾上腺嗜铬细胞瘤（pheochromocytoma）和Leigh综合征。基于琥珀酸底物，通过琥珀酸－辅酶Q还原酶的催化，氧化为富马酸，同时氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIP）转化为还原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIPH2），在分光光度仪下产生吸光峰值的变化（600nm 波长），由此定量测定琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：

产品内容

YIJI缓冲液（Reagent A）          毫升

YIJI反应液（Reagent B）          毫升

YIJI阴性液（Reagent C）           毫升

YIJI底物液（Reagent D）         微升

产品说明书              1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；YIJI反应液（Reagent B）和YIJI底物液（Reagent D），避免光照，有效保证6月

用户自备

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；YIJI缓冲液（Reagent A）室温预热；YIJI反应液（Reagent B）和YIJI底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。

一、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零

二、 背景对照测定

1． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent B）

3． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent D）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent C）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟 

三、 样品活性测定

1． 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升YIJI反应液（Reagent B）

3． 加入xx微升YIJI底物液（Reagent D）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为样品活性读数：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟

四、 计算样品活性

注意事项

1． 本产品为21次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． YIJI反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触

4． 系统操作过程中，背景测定只需1次

5． 线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解（－70℃至37℃）循环3次

6． 如果增强酶活检测，建议使用YIJI线粒体复合物待测样品预处理试剂盒－GMS10342

7． 加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

8． 96孔板测定初始读数（0分钟读数）0.5左右为理想状态；比色皿测定为1.0左右

9． 反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟

10． 测定值由高到低变化，即5分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性

11． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

12． 建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供YIJI线粒体溶解试剂盒GMS10018为后续的线粒体蛋白浓度测定的预处理试剂盒和YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

13． 如果使用细胞或组织裂解悬液，则蛋白浓度为50微克/100微升

14． 线粒体呼吸链复合物II（琥珀酸－辅酶Q还原酶）单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚（DCPIP）所需的酶量作为一个活性单位

15． 本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品 

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确