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细胞样本的前处理

2015-07-22 10:10

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一、匀浆介质 一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。 二、细胞样本的前处理: 1、细胞沉淀的收集: ① 悬浮细胞: 对于悬浮培养的细胞,直接通过离心收集细胞沉淀,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀。 ② 贴壁细胞: 对于贴壁培养的细胞,用胰酶将细胞消化下来,或用细胞刮将细胞刮下来,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀。 我们一般建议客户,细胞密度最好不要小于一百万个/ml。 2、细胞沉淀的洗涤: 在细胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS (等渗), 轻轻颠倒混匀,将培养液在室温条件下1000转/分,离心10分钟,弃上清留细胞沉淀。 重复上述操作反复洗涤1~2次。 3、匀浆的方式:手工匀浆,超声破碎,裂解液裂解,反复冻融。 ① 手工匀浆:在细胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变,一般加入0.5ml,细胞密度不小于一百万个/ml),混匀,将细胞悬浮于PBS中,用移液器将细胞悬浮液移至玻璃匀浆管中(2ml玻璃匀浆管),将玻璃匀浆管置于冰水混合物中,手动匀浆3分钟,然后取破碎好的细胞悬浮液进行测定。 ② 超声破碎: 在细胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变,一般加入0.5ml,细胞密度不小于一百万个/ml),混匀,将细胞悬浮于PBS中,在冰水浴条件下进行如下操作: a、用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用400安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。 b、用超声细胞破碎仪,300W功率,每次超声3~5秒,间隔30秒,重复4~5次。 ③ 裂解液裂解 常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,这三种去垢剂的作用是不同的,或者说作用力量强弱不同。 1、SDS属于离子型去垢剂,最厉害,基本可以把细胞完全破掉,DNA会释放出来,裂解液变得很粘稠。 2、NP-40是很温和的去垢剂,1%浓度的基本可以破坏掉胞膜,而对核膜破坏的作用弱,结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。 3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间,偏向于NP40,也是常用的细胞裂解液成分之一,在保护蛋白活性方面有一定作用(SDS基本会使蛋白变性失活)。 去垢剂属性只是一方面,buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素 由于很多裂解液都是蛋白变性剂,对酶活力的测定有一定的影响,一般不推荐用裂解液进行裂解。 ④ 反复冻融: 在细胞沉淀中加入一定量的PBS(PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变,一般加入0.5ml,细胞密度不小于一百万个/ml),混匀,将细胞悬浮于PBS中,放低温冰箱中结冰,溶解,再结冰,再溶解,反复3次左右)。 由于反复冻融对酶活力影响较大,一般不推荐使用

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请问贵公司的抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)测试盒与TRACP试剂盒是一种东西吗?该测试盒可以检测小鼠RAW264.7(巨噬)细胞上清液中的TRAP含量吗? 回复:trACP与strACP都是指的抗酒石酸酸性磷酸酶,只是英文缩写不同。这个试剂盒属于生化试剂盒,不分种属特异性。细胞中的相应活力可以测定,一般要求细胞数量级在106个/ml密度;大概在6孔板进行培养、收集,并进行破碎处理。 最新产品:TGMD溶液 "货号:CC0100 规格:100ml 储存条件:4℃,6个月 用途:肥大细胞培养 注意事项:主要由Tyrode液、明胶、氯化镁、DNA酶组成。" 抗体储存液 "货号:PZ0050 规格:100ml 储存条件:4℃,24个月 用途:抗体保存液,抗体稳定性好,保存时间长。 注意事项:无菌溶液。主要由氯化钠、磷酸盐、防腐剂等组成,经过滤除菌。" Denhardt's溶液(50×) "货号:NH0008 规格:50ml 储存条件:—20℃,12个月 用途:RNA杂交、单拷贝序列的DNA杂交、DNA固定在尼龙膜上的杂交 注意事项:无菌溶液。主要由Ficoll400、PVP、BSA等组成,有刺激性气味,过滤除菌。" Mallory PTAH染色液(化学氧化法) "货号:DC0003 规格:100ml 储存条件:室温,避光,3个月 用途:肌纤维、纤维素的染色,尤其适用于横纹肌/平滑肌染色 注意事项:染色液采用化学氧化法使其成熟,但保存时间短,染色力同自然氧化法。横纹肌的横纹、纤维素、胞核、红细胞、神经胶质纤维呈深蓝色,胶原纤维、软骨呈棕红色。" 三磷酸腺苷溶液(ATP,10mmol/L) "货号:NP0053 规格:10ml 储存条件:—20℃,12个月 用途:又称腺苷三磷酸,ATP是细胞内一种高能磷酸化合物三磷酸 注意事项:主要由ATP、Tris-HCl等组成。" 葡萄糖溶液(20%,无菌) "货号:R00602 规格:100ml 储存条件:4℃,6个月 用途: 注意事项:" SDS溶液(20%) "货号:R00174 规格:100ml 储存条件:室温,6个月 用途:去污剂,变性剂,裂解细胞 注意事项:加热溶解后调pH值,当温度过低时易形成白色沉淀,加热溶解后即可使用。" 标准蛋白质溶液(BSA,10mg/ml) "货号:OR0016 规格:1ml 储存条件:—20℃,12个月 用途:蛋白浓度测定时的蛋白标准,全称Albumin bovine Solution 注意事项:主要由高纯度BSA(组分五)、超纯无菌去离子水组成。" Luxol Fast Blue染色液 "货号:DK0008 规格:50ml 储存条件:室温,避光,12个月 用途:又称监牢蓝髓鞘染色,石蜡切片 注意事项:分化步骤很重要,染色结果为:髓鞘呈蓝绿色,细胞核呈红色。" DMDC玻片硅化剂(2%) "货号:IH0002 规格:100ml 储存条件:室温,6个月 用途:玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片 注意事项:主要由二甲二氯硅烷(DMDC)组成。" Tris缓冲盐溶液(10×TBS,pH8.0) "货号:PW0014 规格:500ml 储存条件:4℃,6个月 用途:常规PH缓冲液,常用于清洗western blot 中蛋白印迹膜,或者作为封闭液的主要成分。 注意事项:主要由TRIS-HCL(PH8.0)200mmol/L 、氯化钠、9%或1.5mol/L组成。" PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.2-7.4) "货号:IH0142 规格:500ml 储存条件:室温,12个月 用途:多用于免疫组化和细胞染色 注意事项:生物学和医学上经常用的一种磷酸缓冲液,主要由磷酸氢二钠和磷酸二氢钾组成。溶于水后PH约为7.2-7.4。" 黏蛋白异染染色液(天青A法) "货号:DG0062 规格:100ml 储存条件:4℃,避光,6个月 用途:黏蛋白染色 注意事项:酸性黏蛋白和蛋白多糖呈紫色至红色,背景呈蓝色。

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