ELISA试剂盒三种类型的常用方法

ELISA试剂盒操作方法

 （1）将抗原结合在酶标板上。取标准IgG（10mg/mL）用碳酸盐缓冲溶液稀释，得到浓度为0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加标准抗原的两孔为对照，为反应的0%值，将反应板于4℃放置一夜（8个样品，分3个平行，4个100%值孔；共28+2孔）。

（2）标准牛IgG与初级抗体一兔抗牛血清的反应。将标准IgG（10mg/mL）用稀释液作二倍稀释得到一系列不同浓度的标准牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀释好的200μL的兔抗牛血清中，其中4个不加标准牛IgG作为测量时的100%值。4℃反应放置一夜。

（3）封闭板。将包被好的酶标板孔内液体倾去，进行洗涤，各孔加200μL洗涤液后室温下放置1min，倒掉，如此重复4次后，在吸水纸上拍干，ELISA试剂盒加封闭液进行封闭，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封闭液）。封闭后，如前述洗涤。

ELISA试剂盒可用于测定抗体，也可用于检测杭原。其基本原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）； ②酶标记的抗原或抗体（标记物）； ③酶作用的底物（显色剂）。

　　ELISA试剂盒过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原－－待测抗体－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。

　　根据检测目的和操作步骤不同，

3.1间接法  此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体。加人待检标本（含相应抗体）与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。

3.2双抗体夹心法  此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体，加人待检标本（含相应抗原）与之结合。温育后洗涤，加人酶标板中。

3.3竞争法  此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体。ELISA试剂盒加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，ELISA试剂盒使二者竟争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。

一、酶联免疫吸附法测定抗体含量（竞争法）