应用速递 | 通过流动诱导分散分析（FIDA）技术表征构象变化

许多生物学过程通过蛋白与小分子或其他蛋白的相互作用进行调节。在许多情况下，这些相互作用会引起构象变化，该变化直接调节活性或提供新的结合位点，以促进建立高阶复合物。作为模型系统，本次实验我们使用了细菌性结合蛋白超家族的麦芽糖结合蛋白（MBP）。

MBP是麦芽糖糊精转运系统的可溶组分，驻留在革兰氏阴性细菌的周质中，在该细菌的周质中，它可以将其配体（Maltose，Maltotriose和Maltoheptaose）运送到膜结合的转运蛋白复合物。MBP的配体结合位点位于两个球状结构域之间。

图1.（a）MBP（42.5 kDa）Apo状态（左，开放）以及与Maltose（360 Dalton）结合形成的麦芽糖结合态MBP（右，关闭）；（b）MBP的开放式（浅蓝色）和封闭式（浅粉红色）结构的对比。

麦芽糖会引起麦芽糖结合蛋白的构象变化。

FIDA技术提供了对流体动力半径（R_h）的绝对测量，并用于测量与麦芽糖（0.3 kDa）结合后ATTO488标记的MBP（42.5 kDa）的尺寸变化。如图2A所示，在25°C下绘制了MBP表观R_h随麦芽糖浓度（0-1000 µM）变化的函数曲线。MBP的R_h从2.88nm降低至2.62nm，对应于0.26nm的ΔRh，清楚地表明结合后的结构变化（图2A）。结合数学模型，通过流体动力半径（R_h）变化的数据解析，该相互作用亲和力K_D≈10 µM，与文献[1,2]报道一致。在图2中，显示了单独MBP和MBP-麦芽糖的叠加FIDA信号。在图2B中，指示剂峰在麦芽糖存在下变窄。利用FIDA 泰勒分散分布图的峰面积，可同时探测MBP的荧光强度在增加麦芽糖浓度时因MBP与麦芽糖结合发生的变化，即结合相关荧光强度变化（BRIC，Binding Realted Intensity Change）。它表明，MBP的荧光信号受麦芽糖结合的影响（图2B），利用BRIC信号可从第二个维度解析二者亲和力常数K_D≈10 µM，从而实现结合测量的正交估计。

图2.（A）由FIDA在25°C分析的MBP和麦芽糖之间的相关结合曲线。即MBP的Rh随麦芽糖浓度（0-1000 µM）变化的函数曲线。（B）与单独的MBP（实线）相比，当存在麦芽糖（虚线）时，指示剂峰的原始数据曲线变得更窄。