体外3D肺癌模型比2D培养更具相关性的连接蛋白表达

我们比较了在二维聚苯乙烯培养皿上培养的人类肺癌细胞与使用BIO X进行3D生物打印的肺癌细胞。在3D细胞培养中，细胞重新排列成球状体，且连接蛋白的分布在二维培养中无法检测到。

01 文章 

Title:“In Vitro 3D Lung Cancer Model Presents a More Relevant Expression of Junctional Proteins than 2D Cultures”

作者：Josefin Blell, MSc, Shubhankar Nath, PhD,Christen Boyer, PhD, and Itedale Namro Redwan, PhD CELLINK, Gothenburg, Sweden

摘要：肺癌是世界上癌症相关死亡的主要原因之一。为了能够研究这种复杂的疾病和驱动转移的机制，需要开发更多与生理相关的体外模型。本研究将人肺癌细胞分别在二维聚苯乙烯板和3D生物打印的甲基丙烯酸明胶(GelMA)和Matrigel中培养14天，观察球形形成、细胞形态和连接蛋白。定性分析显示，与在二维条件下生长的细胞相比，在三维生物打印模型中，β-连环蛋白和紧密连接蛋白-1的表达模式更具生理相关性。3D生物打印模型中显示的细胞重排成球体和连接蛋白的分布在2D培养中无法检测到，突出了3D微环境的重要性。这些结果表明，3D生物打印有助于建立更相关的体外疾病模型，并可能使研究人员受益于癌症研究、分子生理学和药物开发中的自动化分析工具。肺的重要功能是向身体交换气体。空气从气管进入称为肺泡的最小气囊，肺泡形成呼吸表面，允许气体扩散(Zscheppang, 2018)。

02 前言 

由于进入的空气中含有免疫系统需要对抗的病毒、污染物和过敏原，免疫系统承受着很大的压力。肺癌是世界上最常见的癌症死亡原因(Zscheppang, 2018)。这是一种复杂的疾病，需要更多的生理相关模型来理解细胞异常行为背后的机制。传统上，体外癌症模型是基于二维单层培养的，这有助于研究人员对癌变机制有更深入的了解。然而，研究人员开始意识到使用平面模型研究发生在生物体中的复杂疾病的局限性。哺乳动物细胞嵌入细胞外基质(ECM)中生长，细胞外基质赋予组织机械特性，促进细胞间通讯(Baker, 2012)。因此，必须开发仿生肺肿瘤模型，以便更好、更快地测试潜在的候选药物。此外，转移和癌症进展的研究对于更好地了解这种疾病以及如何对抗它至关重要。癌细胞经常在三维微环境中自组装成多细胞肿瘤球体。这些成熟的结构允许细胞和周围环境之间的相互作用。在本研究中，研究了生物打印3D构建物中肺癌细胞球形结构的形成，并使用相关分子标记，如β-catenin、CD44和(ZO-1)，与2D培养物进行了比较(图1)。

2.1 E-cadherin/β-catenin复合物

E-cadherin/β-catenin复合物在细胞-细胞粘附中起关键作用，特别是在上皮细胞中。具体来说：

2.1.1 E-cadherin/β-catenin复合物的功能

E-cadherin：是一种粘附分子，主要在细胞膜上表达，负责细胞之间的粘附。

β-catenin：与E-cadherin结合，帮助连接细胞骨架，从而维持细胞间的稳定联系。

2.1.2 复合物变化对癌症的影响

当E-cadherin/β-catenin复合物的结构或表达发生变化时，细胞间的粘附会被抑制。

这种变化可能导致细胞之间的粘附力减弱，细胞更容易脱离原有组织，成为游离状态。

这种游离的细胞可能会获得侵袭性特征，能够侵入邻近组织，甚至通过血液或淋巴系统扩散到远处部位，形成转移性癌症。

2.1.3 与癌症的关系

E-cadherin的表达下降或β-catenin定位异常（例如从细胞膜转移到细胞核）常与癌症的侵袭性和转移性增加有关。

这些变化通常标志着上皮-间质转化（EMT）过程的启动，这是一个在癌症发展中常见的现象，涉及细胞从上皮表型转变为间质表型，增强其迁移和侵袭能力。

2.2 CD44

CD44是一种跨膜糖蛋白，在正常和癌组织的细胞表面广泛表达。参与细胞间相互作用、细胞粘附和迁移。高水平的CD44表达与癌症进展有关。

2.3 ZO-1 (Zonula Occludens-1)

ZO-1是一种支架蛋白，决定上皮细胞形成紧密连接链。紧密连接确保质膜顶端和基底外侧区域之间的分离，并作为扩散屏障，介导细胞迁移。ZO-1的表达维持气道和肺泡上皮血管之间的屏障，表明紧密连接的存在。

ZO-1表达异常，紧密连接功能障碍会破坏上皮屏障，促进上皮-间质转化(EMT)和肿瘤转移。

在这项研究中，研究了在3D生物打印的甲基丙烯酸明胶(GelMA)或基质凝胶液滴中肺癌细胞从单细胞重排到球体以及紧密连接的表达，并与传统的2D细胞培养进行了比较。

图1所示：生物打印和连接蛋白信号通路的说明

03  材料和方法 

☆☆细胞培养

• 人肺癌A549细胞系在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。

• A549细胞以800万个细胞/mL的浓度与GelMA或Matrigel Matrix混合，并通过22G喷嘴以10µL的液滴形式分配。

☆☆3D生物打印和培养

• GelMA生物墨水用BIO X™ 3D生物打印机打印并使用405 nm光模块进行光交联。

• Matrigel手动分配到96孔板中并在37℃下进行30分钟的热交联。

• 样品在37°C和5% CO2下培养，每周三次更换培养基，分别在3D或2D环境中培养14天或4天。

☆☆细胞固定与染色

• 3D构建体固定、脱水、浸润、石蜡包埋及切片处理（具体方法见附件1）。

• 2D细胞固定、渗透及阻断处理。

• 使用特定抗体（β-catenin、CD44、ZO-1）进行免疫组织化学染色和共聚焦成像。

图2：第4天A549的2D亮场图像，第14天嵌入GelMA和Matrigel。比例尺= 100µm

生物墨水内细胞的形态及其重新排列环境的能力至关重要。A549细胞在适当的微环境中能够自然自组装成球体。从亮场图像（图2）可以明显看出，A549细胞在2D环境中以单细胞的形式生长，具有平坦的形态，而在生物打印过程中，当A549细胞作为分散的单细胞嵌入GelMA和Matrigel中时，14天后，细胞在生物墨水中自然聚集并形成球体。球体的大小和形状的差异可能表明更类似于体内的模式，但可能是不同肿瘤模型中数据差异的来源。

对A549细胞进行β-catenin染色分析显示，在整个网络中存在不同的表达模式（图3）。在不同细胞区室的定位与其在质膜上的功能有关，在质膜上它与细胞粘附蛋白（如E-cadherin）相互作用并调节细胞间相互作用。结果表明，在二维培养模型中存在细胞核和细胞质定位，而在三维培养模型中表达定位于细胞-细胞连接。先前的研究显示了3D培养中A549细胞的自然环境的相关再现，其中β-catenin表达定位于细胞-细胞连接处，表明极化和粘糖蛋白的产生，而2D培养则没有（Carterson, 2015）。

图3：A549 β-catenin在2D单层细胞中的表达于第4天，在GelMA和Matrigel的3D培养中于第14天。为了更好地可视化定位，对每个条件下的图像处理进行了优化。比例尺= 100µm

CD44在二维和三维中的表达模式相似（图4），这是可以预料的，因为它在正常组织和癌组织中都有表达。在所有条件下，CD44的表达都定位在细胞表面，这也验证了染色方法的有效性。

图4：A549的CD44(绿色)和DAPI(蓝色)在二维单层细胞中的表达于第4天，在GelMA和Matrigel的三维培养中表达于第14天。为了更好地可视化定位，对每个条件下的图像处理进行了优化。比例尺= 100µm

紧密连接在调节内皮屏障功能中起着至关重要的作用。文献显示，在2D和3D聚集体中，连接标记存在差异，其中ZO-1和β-catenin等标记在细胞-细胞界面中有明显的定位，而在2D聚集体中，染色模式是弥散的（Carterson, 2015）。我们的研究结果显示，ZO-1蛋白在二维培养中的表达模式不同，分布于整个细胞内，并在细胞核中有所增强；而在三维培养中，ZO-1蛋白在整个细胞周围表达，表现出极化（图5）。在我们的模型中，可以观察到与Carterson 2015中相同的三维相邻细胞之间连接蛋白的正确组织，表明这些连接复合物更接近体内样式。

图5：ZO-1在A549中的表达(红色)和DAPI(蓝色)。所有的照片都是用相同的曝光时间拍摄的。比例尺= 100µm

与2D细胞培养相比，3D生物打印具有多种优势，包括多细胞结构的精确几何排列，可以更好地再现天然的3D人体生理。细胞根据来自周围细胞和环境的外部信号进行自我组装。这一重要现象有助于理解肿瘤的形成，并有潜力促进药物开发和筛选。

04 结果与讨论 

4.1 细胞形态和球体形成

• A549细胞在2D环境中以单细胞形式生长，形态扁平。

• 在3D生物打印过程中，A549细胞在GelMA和Matrigel中聚集并形成球体，模拟体内环境。

4.2 肿瘤标志物表达

• β-catenin染色显示在3D培养模型中表达定位于细胞-细胞连接处，而在2D培养模型中存在细胞核和细胞质定位。

• 3D培养模型中的A549细胞表现出更具生理相关性的β-catenin表达模式。

4.3 细胞重排和微环境重塑

• 在GelMA和Matrigel中，A549细胞在14天内聚集成球体，而在二维样品中未见此现象。

• 球体结构是药物开发和理解细胞过程的重要工具，能够增加细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用，模拟体内癌症模型。

05 参考文献 

见网址：

https://go.pardot.com/l/894101/2020-11-23/qxj/894101/1606150763BkyhQhDN/In_Vitro_Lung_Cancer_Model_Application_Note_112020v5.pdf