ExoCounter全自动外泌体分析仪应用案例分享

外泌体被应用在多个研究方向，如肿瘤来源的外泌体在肿瘤进展中的作用^[5]、外泌体在药物递送系统中应用^[6]、外泌体在肿瘤及寄生虫病中的应用等多个层面^[7]。肿瘤的侵袭性和耐药性是由细胞间信号转导和细胞间远距离细胞相互作用构成的生物网络所维持，这种纳米级小囊泡能够转移核酸以及脂类等^[8]。越来越多的研究表明，外泌体与肿瘤微环境密切相关。

作者检测了人星形胶质细胞和5种不同的胶质瘤细胞系的mRNA和蛋白水平上的BATF2表达。结果显示U251细胞中BATF2表达降低，U87-MG细胞中表达升高。为了阐明BATF2在胶质瘤形成中的功能，作者使用胶质瘤细胞系U251及过表达BATF2的U251细胞在BALB/c裸鼠颅内进行肿瘤发生试验。后续作者使用MRI和micro-CT等方法学证实BATF2抑制颅内和皮下GBM模型中的肿瘤生长（图1）。

接下来，作者研究了BATF2是如何抑制肿瘤生长的。经Cell Counting Kit-8分析显示，在U251、U87-MG、U118-MG和A172胶质瘤细胞中，BATF2的过表达和下调均不影响体外细胞活力。体外transwell迁移实验显示了BATF2不影响肿瘤细胞的侵袭和迁移。肿瘤皮下组织增殖细胞核抗原免疫组化染色显示，BATF2表达上调并不能抑制肿瘤细胞增殖。

因此，作者假设BATF2可能不是直接调控胶质瘤细胞增殖，而是影响肿瘤微环境。实验中建立胶质瘤模型，发现BATF2过表达抑制GL261皮下肿瘤生长，与预期一致。通过免疫组化等方法得到结论：BATF2抑制胶质瘤进展和Mo-MDSCs浸润（图2）。

肿瘤来源EVs在肿瘤细胞与微环境之间的通信中起着关键作用。因此，作者假设BATF2抑制MDSCs与EVs有关。为了解决这个问题，从U251-Ctrl和U251-BATF2细胞培养上清中分离了EVs。透射电镜显示，U251-Ctrl和U251-BATF2细胞中肿瘤来源EVs的大小分布和形态相似，NTA分析与电镜结果吻合，并使用Western blotting检测表达。

这些数据表明，从U251-BATF2细胞中提取的EVs的BATF2蛋白水平高于从U251-Ctrl细胞中提取的EVs。与sh-NC相比，sh-BATF2细胞系释放的EVs中BATF2含量降低。

为了进一步提供BATF2 - EVs抑制MDSCs趋化作用的体外证据，作者又从携带GL-261的BALB/c裸小鼠中分离脾MDSCs，并从板孔底部过表达或下调BATF2的细胞中接种EVs，并与新鲜分离的脾MDSCs在上室共同孵育16小时。通过计数通过膜侵入的MDSCs数量，作者发现与BATF2- EVs共培养时，与ctrl - EVs组相比，底部的MDSCs数量明显减少。

相反BATF2下调的细胞系的EVs促进了MDSCs体外趋化。用ExoCounter检测EVs的表面蛋白。用金偶联的BATF2抗体孵育的GBM来源EVs，然后用TEM扫描。结果显示，EV表面存在BATF2蛋白，可以标记。

作者使用ExoCounter平台计算了U251-BATF2荷瘤小鼠血浆中BATF2+EVs的数量。作者观察到，当BATF2在U251细胞中过表达时，随着时间的推移，注射U251-BATF2的小鼠血浆和骨髓中检测到BATF2+EVs。这些数据表明当BATF2在肿瘤中过表达时，体内荷瘤小鼠血浆和骨髓中的BATF2+EV浓度可能上调。综上，BATF2过表达细胞的EVs有效地抑制了MDSCs的募集（图3）。

作者用ELISA检测肿瘤中MDSCs相关的趋化因子。数据显示，SDF-1α水平在颅内U251-BATF2 肿瘤显著降低。

然而，GM-CSF、MCP-1、M-CSF和G-CSF的局部表达没有变化。此外，免疫组化染色证实了BATF2与SDF-1α水平呈负相关。后续实验中的Western blotting和ELISA结果显示，在常氧条件下，摄取BATF2- EVs对细胞SDF-1α的表达只有轻微的影响，而在缺氧条件下，BATF2- EVs处理明显抑制了HIF-1α和SDF-1α的表达。

此外，ELISA和qPCR数据均证实，缺氧条件下，BATF2- EVs处理抑制了SDF-1α的表达。Western blotting和ELISA检测证实，BATF2抑制U251细胞内源性HIF-1α和SDF-1α。本组实验数据表明，SDF-1α水平在BATF2- EVs中降低，BATF2诱导的Mo-MDSCs招募抑制可能与SDF-1α有关（图4）。

接下来，作者使用AMD3100阻断SDF-1α/CXCR4信号，并研究了CXCR4阻断剂对肿瘤生长的影响。首先，作者将U87-MG和sh-BATF2转导的U87-MG细胞分别植入BALB/c裸鼠皮下和瘤内注射AMD3100。U87-MG细胞中BATF2的下调确实促进了肿瘤生长。

有趣的是，AMD3100治疗显著降低了BATF2敲除U87-MG细胞中的肿瘤生长。使用ELISA等方式检测后表明这些与MDSCs相关的促瘤细胞因子也被AMD3100阻断。综合来看，BATF2最有可能通过SDF-1α/CXCR4信号的降低抑制肿瘤生长和MDSCs的募集。因此，用AMD3100阻断CXCR4信号可以逆转BATF2下调的影响（图5）。

为了确定这一发现是否具有临床相关性，作者对胶质瘤组织切片进行BATF2、SDF-1α、HIF-1α、CD14和CD33染色。IHC染色显示BATF2蛋白表达与SDF-1α表达呈负相关。

观察一致认为HIF-1α/SDF-1α在抑制BATF2在胶质瘤组织中募集MDSCs中起作用。肿瘤衍生的EV可以随外周血进入体循环，并且已经证明血浆中的EV对肿瘤进展有影响。高水平的EV与低MDSCs浸润相关，后者反过来抑制胶质瘤的进展。

因此，作者接下来尝试使用ExoCounter检测胶质瘤患者和健康人肿瘤组织和血浆中BATF2+EV的丰度。详细的临床数据汇总在表1中，作者发现肿瘤组织中BATF2+EV计数结果可以区分I–II和III–IV期GBM患者与健康供体。

引人注目的是，基于ExoCounter的血浆中BATF2+EV数量变化也可以区分健康人和I–II期GBM与III–IV期GBM患者。与上述数据一致，作者发现血浆中BATF2+EV的数量与胶质瘤分期之间存在显著的负相关，即血浆中BATF2阳性EV的数量越少，胶质瘤的进展越快。总之，BATF2蛋白状态可以提供GBM特异性液体活检，有助于评估胶质瘤分期（图6）。

外泌体是反映肿瘤进展的有效标志物，在液体活检领域发挥着重要作用。可作为肿瘤治疗和干预化疗抗药性的生物靶点，同时可作为肿瘤诊断及预后的潜在生物标志物，近年来不同的研究证实血浆EVs (plEVs)可作为诊断呼吸系统癌症^[10]、消化系统癌症^[11]、泌尿系统癌症^[12]以及胶质瘤等其他种类癌症^[1]的潜在生物标志物。

随着蛋白质组学和基因组学等分析手段的发展，外泌体介导的生物学效应及其背后的分子机制将会更加清晰，但在此类研究过程中，外泌体的提取纯化、鉴定及合理保存是首要步骤，也是一切后续实验的基础，毕竟只有高纯度、高活性的外泌体才能确保后续实验的质量和可信度。目前常见的外泌体提取方法有：超速离心法（差速离心法）、蔗糖密度梯度离心法、超滤法、PEG沉淀法、色谱法等方法，但是这些方法在分离外泌体的过程中都无法做到精确和便捷^[13-19]。

文中使用的外泌体绝对计数设备ExoCounter全自动外泌体分析仪是由希森美康公司和JVCKenwood公司联合研发。ExoCounter使用纳米尺寸区分技术结合免疫亲和技术，可对生物体液样本和细胞培养上清中特异来源外泌体进行快速准确计数。无需外泌体富集过程，节省实验时间的同时避免了外泌体在富集过程中的损失，多种可定制试剂盒满足对不同疾病和不同组织来源外泌体的精确计数，仅需12.5ul样本，兼容稀有体液外泌体检测，同时检测16个甚至更多样本的高通量设计适合大规模样本临床科研研究。ExoCounter全自动外泌体分析仪已经成为外泌体研究中一项不可或缺的强大工具。

参考文献