高通量蛋白相互作用分析方法汇总

       作为生物体的重要组成部分和生命活动的重要物质基础，蛋白质几乎参与了所有的生命活动，包括生物体内的物质代谢、免疫反应、信号转导、催化作用等。因此，研究蛋白-蛋白相互作用，并进一步勾画出生物体内蛋白相互作用网络，有利于我们更加透彻地理解生命活动基础。
       传统的免疫共沉淀、gst pull down、far western blot等生化方法需要进行蛋白免疫印迹检测，工作量大、时间长，尤其是在进行大规模蛋白截短筛选或药物靶点筛选时，更需要配置多块凝胶进行电泳、转膜、孵育、曝光，过多的操作步骤会引入更多的影响因素，影响结果的真实性。
       酶标仪可对微孔板进行读数，一次检测可获得整个孔板的数据。利用荧光分子标记待研究蛋白，当该蛋白与另一蛋白发生相互作用时，荧光会因为蛋白分子运动特性或两蛋白分子间距离的改变而改变。酶标仪的高级荧光检测功能能够识别这种荧光的改变，反映所需研究蛋白是否与其他蛋白发生相互作用以及这种相互作用的程度。目前，适用于酶标仪的蛋白相互作用检测方法主要有以下三种：荧光能量共振转移、荧光偏振和alpha筛选。
一、荧光能量共振转移（fluorescence resonance energy transfer, fret）
       荧光能量共振转移是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，fret已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具。
       荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即fret现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多（荧光猝灭），而受体发射的荧光却大大增强（敏化荧光）。受体荧光强度与供体荧光强度的比值，则反映了两种蛋白间相互作用的强弱（图1）

图1 荧光能量共振转移原理示意图

二、荧光偏振（fluorescence polarization，fp）    
       光波可以在任何一个平面上均匀振动。当其通过某个平面时，有可能受到平面作用将光波分成不均匀光束。可能在某一个方向上的振动强度强或弱于其他方向的振动强度，这种光称为偏振光。（图2）

图2 偏振光示意图

       荧光分子在受到偏振光激发时，如果分子保持静止，该分子将发出固定偏振平面的发射光（发射光仍保持偏振性）。然而，如果分子旋转或翻转，那么发射光的偏振平面将不同于初始激发光的偏振平面。为了检测a、b两种蛋白间是否有相互作用，可使用荧光素标记a蛋白，单独的a蛋白分子小，旋转或翻转速度快，因此偏振光激发产生的发射光偏振程度低；当a蛋白与b蛋白发生相互作用时，形成大分子，运动相对较慢，因此偏振光激发产生的发射光偏振程度较高。利用酶标仪检测发射光偏振改变程度，能够估计a、b两种蛋白相互作用强弱。（图3）

图3 荧光偏振原理示意图

三、alpha筛选(alphascreen)
       alphascreen系统含有两种核心物质，一种为donor bead，另一种为 acceptor bead，当 donor bead所带有的a分子与acceptor bead所带有的b分子产生交互作用时，可以680nm激光去激发donor bead表面所带有的光敏感物质，使其催化周遭的氧分子形成活化态，此活化态的氧分子可与邻近的acceptor bead产生化学冷光化反应，并进一步由能量转换激发acceptor bead所带有的荧光物质产生520-620 nm的荧光信号，反映a、b两分子是否发生相互作用以及相互作用程度。（图4）

图4 alpha筛选原理示意图

       当然，包括alpha筛选在内的多种分子互作检测技术不仅能够用来反映分子间相互作用，还可以通过竞争结合检测目的分子浓度。camp作为第二信使，在细胞信号转导过程中具有重要作用。反应体系中donor bead包被了亲和素，用来偶联生物素化的camp，acceptor bead表面为anti-camp抗体。生物素化的camp能够将donor bead与acceptor bead距离拉近，单体氧分子能够传递至acceptor bead，发生化学反应，转化成光信号。当细胞裂解液加入反应体系时，胞内游离的camp与生物素标记的camp竞争性结合抗体，荧光强度降低，间接反映细胞裂解液中游离camp浓度。
       利用酶标仪进行高通量分子互作筛选，能够大大提高靶向药物、蛋白功能域筛选效率，并反映出目标分子的浓度。这将大大加快生命科学研究过程中人们认识完整信号转导通路的速度，并帮助找到信号通路关键节点的关键干预位点，加快生命科学研究成果向医学应用的转化。