新技能get！让细胞凋亡数据丰富起来

    细胞凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下按特定顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡检测可以用于基础医学研究，新药研制，生物制品开发等多个领域，在生物学、医学发展过程中具有举足轻重的地位。
    细胞凋亡不同时期有不同变化。细胞凋亡早期，磷酯酰丝氨酸（Phosphatidylserin，PS）外翻，AnnexinⅤ在Ca2+存在情况下与PS结合，存在于细胞表面；细胞凋亡中期，线粒体膜电位破坏，包括细胞色素C在内的多种促凋亡因子在内被释放，效应Caspases被激活,产生凋亡小体;细胞凋亡晚期，染色体DNA断裂，产生180bp-200bp或其整数倍的DNA片段，这些片段带有游离3'-OH末端。由于细胞凋亡不同阶段的特定指征只能维持一段时间，所以需要在不同的时间点采样，检测多种指标，才能保证检测结果准确性。
    流式细胞术是目前进行细胞凋亡检测比较常用的技术，可以实现单细胞层面AnnexinⅤ检测、线粒体功能检测、Caspases 酶活检测和DNA断裂检测。其实，我们还可以结合成像和酶标的方式，以较为直观的方式提供更多的辅助证据，使我们的文章结论更具说服力。
    JC-1探针是一种电位敏感探针，正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光；不健康的线粒体由于膜电位的下降或丧失，JC-1只能以单体的形式存在于胞浆中，产生绿色荧光。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。北德克萨斯大学健康科学中心正是使用线粒体JC-1探针，在Biotek cytation 5提供的恒温常氧环境中，实现了长达8小时的凋亡细胞线粒体电位变化连续监测。（图1）

 图1

    美国北德克萨斯大学健康科学中心使用特殊的Caspase3/7酶活底物，借助Biotek Cytation5的气体控制功能，实现了常氧和缺氧条件下，Caspase3/7酶活检测，其主要原理就是特殊底物被Caspase3/7切割后可释放出萤火虫荧光素酶底物，该底物在萤火虫荧光素酶作用下发光，通过发光强度确定Caspase3/7酶活。最终实现了细胞凋亡中期指标的检测。（图2）

 图2

    美国NIH借助Biotek Cytation3，使用双染法对细胞进行凋亡检测，证明Englerin A对尤文肉瘤细胞具有凋亡诱导作用。荧光染料Hoechst 33342能少许进入正常细胞膜，使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst 33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高。活细胞对PI染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色。根据这些特性，用Hoechst 33342结合PI染料对凋亡细胞进行双染色，就可以将处于凋亡中晚期的细胞和已经死亡的细胞区分开来。（图3）

  图3

    当然，除了上述介绍，western blot、细胞形态改变、DNA ladder等多种方法也可以用来丰富细胞凋亡数据。随着生物技术的不断发展，针对细胞凋亡过程中不同阶段不同特点，我们对于细胞凋亡的认识将越来越深刻。
 
参考文献：
Vittorio Caropreso, Emad Darvishi, Thomas J. Turbyville, et al. Englerin A Inhibits EWS-FLI1 DNA Binding in Ewing Sarcoma Cells[J]. J Biol Chem, 2016, 291(19): 10058–10066.
Park YH, Broyles HV, He S, et al. Involvement of AMPA Receptor and Its Flip and Flop Isoforms in Retinal Ganglion Cell Death Following Oxygen/Glucose Deprivation[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2016, 57(2):508-26.