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诱导表达后细胞超声波破碎实验分享
2022/12/12 15:46
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方案摘要：
产品配置单：
HR-650E智能型超声波细胞破碎仪【沪析】
型号： HR-650E
产地： 上海
品牌： 上海沪析
¥1.6万 - 2.3万
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方案详情：
实验目的
获取蛋白分子量和等电点，推算诱导蛋白分子量：
方法一：
Mr=115*1000/3=38*10³Da
（1个氨基酸的大约分子量为115）
Mr=1*37=37kDa
（1kb DNA对应333个氨基酸，大约37kDa）
方法二：
将氨基酸序列输入特定的软件中，获取蛋白的分子量和等电点性质。
实验材料
LB培养基（Luria-Bertani），PBS缓冲液（phosphate buffered saline），离心机，移液器，超声波破碎仪
实验步骤
利用实验确定的最佳诱导条件进行大量诱导表达，将诱导后的菌液转移到离心管中（15ml），配平后，4000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体；
用等体积PBS缓冲液洗涤菌体1~2次，然后4000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体；
用10ml PBS缓冲液进行悬浮（每1g菌体加入10ml缓冲液），离心洗涤；
将超声发射杆插入菌悬液中，并拧紧夹子，将菌液管固定好，然后将装冰水的烧杯通过托架向上抬起，将菌悬液置于冰水中；
超声条件：功率50W`150W，工作1s，间隙2s，温度控制在30℃以下，冰浴条件下开始超声破碎，超声总时间10~30min；
超声结束后，取出样品，并用无菌水清洗超声杆；
超声破碎后，菌悬液变轻；
溶液配平后，4℃，12000rpm离心20min；
离心结束后，将上清液转移到新的离心管中，作为粗酶液；
取出40μl的粗酶液作为细胞破碎的上清液；
沉淀部分用10ml PBS缓冲液悬浮，然后取出40μl作为细胞破碎沉淀的悬浮液；
将超声波破碎的上清样品与沉淀悬浮样品，放入-20℃冰箱中保存备用；
SDS-PAGE分析，样品有诱导前、诱导后、破碎、上清、破碎沉淀；
利用可溶性蛋白及超声波破碎细胞的上清液、粗酶液，准备过清和层析柱。
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