利用CRISPR/Cas9进行NGS建库和细菌克隆

Cas9本质上是一种核酸酶，虽然科学家发现Cas9在真核细胞的基因靶向和编辑中具有重要作用，但是新的研究也在将Cas9用于体外和微生物细胞中来剪切DNA。

过去6个月，多篇研究表明，作为一种可编程核酸酶，CRISPR/Cas9有多种新应用。3月份，加州大学旧金山分校（UCSF）Joe DeRisi领导的研究人员在Genome Biology上发表了一篇文章，他们利用Cas9从下一代测序文库和基于PCR的诊断中去除不需要的DNA种类。上个月，清华大学朱听课题组发表了一种方法，利用Cas9克隆细菌中100k长度的基因组序列。其他研究也证实Cas9在体外的应用提高了效率，扩大了合成生物学的可能性。很多人都预测，CRISPR正在成为生物学家研究中一种可靠、简便的工具。

DeRisi说，“这只是Cas9和Cas9-like蛋白在体外应用的冰山一角。这些应用正纷纷浮出水面。”哈佛医学院George Church实验室的临床研究员Alejandro Chavez说，虽然目前CRISPR/Cas9的实验室应用已经很常见，但仍有许多新的应用待开发。

利用Cas9优化基础实验室工作

早前科学家们就发现了利用Cas9优化基础实验室工作的方法。2014年，首尔大学Jin-Soo Kim带领的韩国科学家们在Nature Communications上发表了一种方法，利用CRISPR/Cas9进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，实现基因分型。

作者在文章中写道，“RFLP分析是最古老、最方便和最便宜的基因分型方法之一，但是这种方法受限于可利用的限制性内切酶位点。”利用Cas9，可以解决感兴趣的基因组区域内不存在可使用的限制性酶切位点的问题。安捷伦公司发言人告诉GenomeWeb，客户们已经开始使用他们公司生产的SureGuide CRISPR/Cas9 kit进行克隆，但是他们拒绝提供案例。

在Kim的研究结果发表1年后，美国国家癌症研究所（NCI）的科学家们证明，Cas9可用于酵母整个基因的转化介导的重组（TAR）克隆，包括远端区域和长染色体位点。他们将这种方法的效率提高了一个数量级，从0.5%~2%提升到32%。他们的研究发表在Nucleic Acids Research。

CATCH方法：克隆细菌中100k长度的基因组序列

同一时间，清华大学朱听研究组也描述了一种类似的方法，克隆较大的微生物基因和基因簇。他们可以一步克隆大片段微生物基因组序列，最高可达100kb。

朱听的方法称作CATCH，是Cas9-Assisted Targeting of Chromosome segments的缩写，发表在Nature Protocols上。该方法在琼脂糖凝胶中进行，他表示这样可以防止DNA打断（DNA shearing）。将细菌包埋到胶中，裂解细胞，RNA介导的Cas9消化细菌染色体，然后将目标区域连接到克隆载体上。最后将载体电转到新细胞中用于生产。

CATCH技术示意图

Chavez说，“这在以前是很难做到的。”朱听的方法可以加速宏基因组研究。Chavez说，为了生物制品和药物研发，科学家们一直在研究细菌基因组中的操纵子区，该区域编码了一个启动子和一个完整的基因通路。细菌中的操纵子有时很难培养，由于片段太大无法用PCR克隆。基于CRISPR的克隆可以帮助科学家们利用微生物的海量酶类完成特定任务，并将其应用到人类研究中。

朱听和其他共同作者在Nature Communications文章中提到，CATCH同样还能应用于测序。他们说，CATCH技术可以从已知的侧翼序列分离邻近任意的DNA片段，加速填补了测序基因组的gaps。同时它还能帮助进行人类疾病特异性基因的靶向测序。

DASH方法：实现靶向富集

这正是DeRisi及其UCSF同事的工作，他们利用Cas9来优化NGS和PCR技术。他们开发出一种方法，称作DASH，是Depletion of Abundant Sequences by Hybridization的缩写，即通过消除来实现浓缩。DeRisi说，“实际上是通过消除你不需要的东西达到富集的效果。”

DASH技术示意图

DeRis小组在发表于Genome Biology的文章中表示，这种方法既可以减少HeLa细胞中的线粒体rRNA，又可以富集病人样本中存在的病原体DNA。这个概念非常简单：利用CRISPR/Cas9切除掉那些不需要的DNA种类阻止它们扩增。任一被切除的序列都没有侧翼接头，因此也不会进行扩增。对NGS而言，这一步可用于建库后和测序前。

DeRisi说，“这个过程一共需要5万~10万个向导RNA（guide RNAs）来移除所有我不希望存在的东西，它的特异性极高。你可以在不知道目标区域是什么的情况下获得靶向富集。”

利用磁珠进行消除也是一种类似的方法，但DeRisi认为，与DASH相比，磁珠的方法草率、不精准且不定量。莱斯大学教授David Zhang和他的公司Searna同样在研究一种杂交的方法消除野生型DNA，应用于测序和PCR。

DeRisi和Chavez都指出这种方法可应用于诊断。DeRisi说，“如果我对一个人类样本测序来检测是否含有病原体，99%的DNA是人类的。这并不是我希望看到的，我希望看到的是病原体。”

对于癌症诊断，DASH可以帮助解决那些深度肿瘤测序无法解决的问题。Chavez说，“在NGS扩增步骤中会产生错误，你可能发现了一些癌症等位基因，但是实际上它们并不是真的存在。”

在液体活检中，去除野生型DNA非常有用。Chavez说，对于实体瘤，小肿瘤脱落的DNA比大肿瘤少。通过消除野生型DNA富集循环肿瘤DNA可以帮助监测和诊断那些小肿瘤。关键在于特异性，这是临床诊断需要而CRISPR/Cas9可以提供的。

DeRisi说DASH很便宜，每个反应约4美元。他表示还没有将这项技术商业化的计划。他说，“每个反应4美元，任何人都可以在实验室使用它，这类工具不应该被专有，它的应用也不应该。”