2017/08/01 14:19
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Proteonavi S5的溶出行为2 ~与他社色谱柱的比较及柱温的影响~
Proteonavi S5的溶出行为3 ~柱温80℃条件下的耐久性及峰形考察~
Keywords : Proteonavi、肽类、蛋白质、缓激肽、0.1 vol%HCOOH、柱温80℃、耐久性、峰形
Proteonavi S5是一款以孔径为30 nm的硅胶作为基材、键合C4基团的蛋白质?肽类化合物分析色谱柱。上回的《Proteonavi S5的溶出行为~与他社色谱柱的比较~ 1》中介绍了以6种蛋白质作为样品,将ProteonaviS5与他社色谱柱进行溶出行为比较的试验。
本次,以5种肽类化合物(缓激肽、后叶催产素、血管紧缩素II、神经降压素及血管紧缩素I)作为样品,将Proteonavi S5与一款填料表面带有正电荷的杂化型色谱柱(孔径13 nm、粒径3.5 μm )进行比较。
图1为所得结果。流动相为添加了0.1 vol%甲酸的水-乙腈系统,在梯度条件下对两款色谱柱进行了溶出行为的考察。
结果,他社色谱柱对于肽类化合物的整体保留较弱,且缓激肽的峰未能得到确认;与此相对,Proteonavi S5对这5种肽类化合物均得到了良好峰形以及充分的保留与分离。
图1 两款色谱柱分析所得色谱图
~柱温与溶出行为~
对肽类化合物进行分析,有提高柱温的做法。例如,《第17改正日本药局方》中,环孢菌素是在柱温80℃附近的一定温度下进行分析的。
在此,以环孢菌素A作为原料,在等度条件下对色谱柱柱温变化及相应的溶出行为进行了考察。图2为所得结果。
如图2,随着柱温的上升,环孢菌素A的保留逐渐减弱,峰形也愈发尖锐。一般来说,与小分子相比,大分子的扩散速度较慢,因此色谱峰形有展宽的趋势,而设定较高的柱温可以使峰形变得尖锐。
像这样,在对肽类化合物进行分析时,设定较高柱温可以使分析时间缩短,提高定量准确性。
图2柱温与环孢菌素A溶出行为的关系
图3环孢菌素A的保留时间维持率(%)与首次进样和连续500次进样所得色谱图
对于环孢菌素A这样的高分子化合物,随着柱温的上升,其扩散速度加快,因而峰形会更尖锐。进一步,针对提高柱温的效果,以环状肽类化合物表面活性肽(M.W. 1036.3)作为分析对象,将柱温分别设定为40℃和80℃进行分析。图4为分析所得结果。将柱温由40℃提高到80℃,保留变弱的同时,表面活性肽的理论塔板数提高了1400。
综上,在对肽类化合物进行分析时,在高柱温条件下使用耐久性良好的ProteonaviS5色谱柱进行分析,提高柱温是获得尖锐峰形的技巧之一;在缩短分析时间的同时,检测灵敏度和定量准确性也能得到提高。
图4 柱温40 ℃及80 ℃条件下对表面活性肽的分析色谱图
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