植物蛋白研究案例分析

植物蛋白研究案例分析

引言

过敏是一种免疫系统的超敏反应性疾病。根据流行病学研究，目前世界上很多国家20-30%的人口患有过敏症，而且这一比例有不断增长的趋势.

花粉是临床相关户外过敏原的重要来源，是公认的主要触发，并引起呼吸道过敏性疾病的原因.

过敏原是一类具有广泛分子量（5-50 kDa）的蛋白，表现出不同特点的水溶性和稳定性，与免疫系统接触后，能够引起IgE介导的超敏反应。新型过敏治疗的研发需要鉴定出多样化和典型的过敏原。这项研究描述了鉴定过敏原的一种有效方法.

概述

关键词: 过敏原，IgE免疫反应，花粉匀浆，超敏反应群体，DNA提取

研究目的: 研究从花粉颗粒中快速提取蛋白质的方法

应用: Western blot 分析

样本名称: 桦木、荨麻、墙草花粉

样本类型: 花粉

材料: FastPrep-24™ 5G仪器, 2ml低温适配器, 2ml的裂解介质管C和E

缓冲液: PBS

实验步骤

A-震荡孵育方法

1.在2ml裂解介质管C或E中加入500ulPBS和50mg花粉

2.将管子置于冷室的摇床上震荡18小时

3.4°C，18000g离心悬浮液20分钟

4.在分析之前将上清液储存在-20°C

B - FastPrep®研磨方法

1.在2ml裂解介质管C或E中加入500ulPBS和50mg花粉.

2.将裂解介质管放入含有干冰的低温适配器中.

3.运行FastPrep-24^TM 5G：以6.0m/s的速度运行40秒.

4.4°C，18000g离心裂解介质管20分钟，沉淀残渣.

5.在分析之前将上清液储存在-20°C

实验结果

图一：光学显微镜观察松木花粉（200X），FastPrep-24™ 5G仪器研磨之前和之后。

左：研磨前的花粉颗粒。右：用FastPrep-24™ 5G仪器配合裂解介质C和E研磨后的花粉颗粒.

实验结果表明用FastPrep-24™5G和裂解介质C能够完全破碎花粉颗粒的结构。

图二：震荡孵育方法与FastPrep®方法提取8个松木花粉样本蛋白质的结果比较。用4批不同的松木花粉重复四次。用考马斯亮蓝染色的方法检测蛋白质浓度。

实验结果表明与震荡孵育方法相比用FastPrep-24™5G仪器可提取得到的蛋白质浓度较高，且浓度高达2mg/ml。

图三：震荡孵育方法（OVN）和使用裂解介质C或E的FastPrep®方法提取的蛋白质的结果比较。考马斯亮蓝胶染色。

实验结果表明对所有测试的花粉，用FastPrep-24™ 5G仪器能有效的提取蛋白质。

图四：用FastPrep-24™ 5G仪器得到的花粉提取物IgE免疫活性检测。左：6个桦树花粉过敏的患者对桦树花粉蛋白（9-14）测试IgE免疫活性。中间和右：12个草本花粉过敏的病人对荨麻和墙草花粉蛋白测试IgE免疫活性（17-22和25-30）。相对分子量用KDa来表示。15, 16, 23, 24, 31 和 32 为阴性对照。

实验结果表明用FastPrep-24™ 5G仪器得到的花粉提取物具有IgE免疫活性检测。

图五：荨麻和墙草花粉用Fastprep®的方法及震荡孵育的方法提取的蛋白质电泳图谱的比较。4种提取物均未经稀释或浓缩。8-18%SDS-PAGE胶。考马斯亮蓝胶染色。

实验结果表明用FastPrep®方法提取的蛋白质含有多种成份。

结论

1. 与需要过夜震荡孵育的方法相比，fastprep-24^TM 5G仪器能更有效的从花粉样本中提取蛋白质。

2. FastPrep®方法的有效性表现在可以定量，高蛋白质产量，和可以定性，提取的蛋白含有多种组分。

3. FastPrep®是一个强大的工具，它能够快速和高度重复的提取蛋白质，并可直接用于下游SDS-PAGE胶电泳分析。

4.使用FastPrep-24 5G仪器提取的蛋白质在IgE免疫反应中是可信的。