Cancer Cell|陆军军医大学卞修武院士团队利用Tissue Cytometry揭示胶质瘤血管

扩散性胶质瘤，包括异柠檬酸脱氢酶（IDH）-野生型（wt）胶质母细胞瘤（GBM）和IDH突变型星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，是成人中最常见的恶性脑肿瘤。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是扩散性胶质瘤中占主导地位的免疫浸润细胞。TAMs直接与恶性细胞互动，促进肿瘤进展，并作为免疫抑制微环境的建筑师。因此，TAMs已成为一个有吸引力的治疗靶点。

作为实体瘤的标志，缺氧与肿瘤坏死、新生血管形成以及各种炎症和趋化因子的产生有关。缺氧肿瘤线索在空间上受到限制，并可能引导肿瘤和生态位细胞的基因组不稳定性、转录适应和代谢重编程。此外，缺氧生态位中增强的 TAM 募集和免疫抑制肿瘤-髓样细胞相互作用增强了神经胶质瘤对化疗和免疫治疗的耐药性。这促使研究者确定缺氧生态位线索如何扭曲缺氧-TAM特征，以及缺氧TAM如何与其他细胞相互作用以促进肿瘤进展。

2024年4月18日，陆军军医大学第一附属医院（重庆西南医院）全军临床病理学研究所卞修武院士、时雨副教授、平轶芳教授团队联合陆军军医大学第一附属医院脑胶质瘤医学研究中心、神经外科李飞副教授、华中科技大学武汉光电国家研究中心张智红教授团队的祁淑红副研究员在Cancer Cell(IF=50.3) 发表文章“Identification of hypoxic macrophages in glioblastoma with therapeutic potential for vasculature normalization”。揭示了胶质母细胞瘤中缺氧巨噬细胞的存在和它们在肿瘤血管正常化治疗中的潜在作用。

在扩散性胶质母细胞瘤中，单核细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞（Mo-TAMs）以显著的异质性密集浸润。通过单细胞转录组学，作者绘制了51名携带异柠檬酸脱氢酶（IDH）野生型胶质母细胞瘤或IDH突变型胶质瘤的患者的Mo-TAMs的空间分辨率转录景观。通过生物体内原位效能验证技术表征了一个定位于坏死周边区域的Mo-TAM亚群，受缺氧生态位线索的影响，获得了缺氧反应特征。缺氧-TAM通过激活肾上腺髓质素旁分泌信号，破坏内皮细胞黏附连接，从而刺激了一个高通透性的新生血管，阻碍了胶质母细胞瘤异种移植物中药物的传递。

因此，通过遗传消除或药物阻断缺氧-TAM产生的肾上腺髓质素，可以恢复血管完整性，提高抗肿瘤药物达布拉非尼的肿瘤内浓度，并实现联合治疗效果。缺氧-TAM的比例增加或肾上腺髓质素表达预示着肿瘤血管高通透性和胶质母细胞瘤的不良预后。文章发现突显了Mo-TAM的多样性和空间生态位引导的Mo-TAM重编程，暗示了针对缺氧-TAM以正常化肿瘤血管的潜在治疗方法。

实验部分

原位转录组技术不但可以通过测序技术对差异化表达的基因进行深度鉴定，还提供了组织原位的空间定位数据，从距离特征上对关键基因的作用关系进行了探索。但与此同时，现有的原位转录测序技术精度尚达不到亚细胞分辨率，同时在细胞功能承载的蛋白层面，仍然缺乏可靠的数据一致性比对方案。

本文作者大量应用了Tissue Cytometry技术，利用抗体对样本中超多靶标蛋白进行荧光标记后，从血管形态，肿瘤及其坏死区域识别，缺氧空间微环境范围构建并探索微环境中细胞和血管的作用关系。

这种原位数据校验的思路，不但填补了原位转录组技术的空白，同时进一步提升了数据的可靠性，对文章观点进行了强有力的支撑。

Figure 1 在hGBM组织上揭示空间梯度下的相关细胞特征

（E） hGBM 坏死周围区域 ADM、半乳糖凝集素-3 和 CD31 的 H&E 染色和免疫染色。虚线表示距坏死核心的距离（600 微米/线）。用正方形表示的区域被放大，并以每种颜色或底部不同颜色的组合显示。比例尺，200 微米。

文章作者对hGBM组织进行H&E染色和免疫染色，借助Tissue Cytometry技术，利用StrataQuest软件对缺氧-TAM的空间特征进行定量分析，发现在hGBM的坏死区域周围，存在丰富的缺氧-TAM伴随着丰富的微血管，确定了缺氧-TAM在缺氧生态位中的功能意义。对ADM和Galectin-3（Mo-TAM标记物）的共表达进行空间定量分析，确认了缺氧-TAM靠近hGBM组织中的伪栅栏状坏死区域。这些数据证实了缺氧-TAM在hGBM组织的缺氧生态位中的富集。

Figure 2 ADM敲除可以恢复mGBM异种移植物的血管完整性

（D 和 E）右旋糖酐标记的肿瘤脉管系统 （D） 的活体成像和 WT 和 Adm cKO 异种移植物中血管结构的定量 （E）（n = 15 张图像/组）。比例尺，100 微米。

（G） 异种移植物中 VE-钙粘蛋白、claudin-5、层粘连蛋白、PDGFRb、尸体碱和 CD31 的免疫染色（n = 15 图像/组）。比例尺，25 微米。

借助TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统，作者利用多重免疫荧光技术对Adm cKO异种移植物组织样本进行VE-cadherin, claudin-5, laminin, PDGFRb, cadaverine和 CD31的多重免疫染色，并获取多色荧光图像。使用StrataQuest软件，对多色荧光图像首先去除非特异背景，优化血管和其它标志物染色，进而利用AI classifier对血管进行特异性识别，同时定量分析各种标志物的蛋白表达。

结果显示，在ADM cKO异种移植物中，内皮粘附连接标志物血管内皮（VE）-钙粘蛋白的表达基本恢复，而紧密连接标记物claudin-5、周细胞标记物血小板衍生生长因子受体和血管基底膜标记物层粘连蛋白的表达不受ADM敲除的影响。使用cadaverine评估肿瘤血管通透性显示，与野生型异种移植物相比，ADM cKO异种移植物的cadaverine渗出面积显著减少。这些数据表明，敲除ADM选择性地恢复了肿瘤血管的完整性，并减少了mGBM异种移植物中的血管渗漏。

Figure 3 ADM通过激活CRLR信号通路破坏内皮细胞粘附连接

（B） 用 rhADM 或载体处理的 HBMEC 中 VE-钙粘蛋白的免疫染色。比例尺，10 微米。

（C 和 D）用缺氧-TAM-CM 和/或 AMA 处理的 HBMEC 中 VE-钙粘蛋白和荧光素-链霉亲和素 （Strep） （C） 的免疫染色以及 VE-钙粘蛋白区和链球菌区 （D） 的定量（n = 5 个样本/组）。比例尺，20 微米。

作者利用多重免疫荧光技术对hGBM组织进行ADM，CRLR和CD31的多重免疫染色并获取图像，使用Tissue Cytometry技术定量分析免疫染色的共定位表达，结果证实CRLR和内皮细胞标记物CD31的共定位在hGBM坏死区域周围伴随ADM信号上调。ADM通过激活内皮细胞中的CRLR信号破坏其粘附连接。

Figure 4 AMA治疗可使hGBM异种移植物中的肿瘤血管系统正常化

（A） hGBM 组织中 ADM、VE-钙粘蛋白和 CD31 的免疫染色。hGBM（n = 41 例）根据 ADM 细胞的比例进行分层。比例尺，50 微米。

（B） hGBM 组织中 VE-钙粘蛋白信号的定量（n = 41 例，5 张图像/例）。

（D 和 E）VE-钙粘蛋白、尸体和层粘连蛋白 （D） 的免疫染色，以及 hGBM-3 异种移植物和小鼠正常大脑中尸体渗出区域和 VE-钙粘蛋白血管 （E） 的百分比（n = 15 张图像/组）。比例尺，10 微米。

（F 和 G）Pimo 的免疫染色 （F） 和异种移植物中 Pimo 肿瘤面积 （G） 的百分比（n = 15 图像/组）。比例尺，50 微米。

（H 和 I）异种移植物中 Dox （H） 和 Dox 肿瘤区域 （I） 的百分比的免疫染色（n = 15 张图像/组）。比例尺，50 微米。

作者利用多重免疫荧光技术对hGBM组织进行ADM, VE-cadherin 和CD31 免疫染色，利用StrataQuest软件，对hGBM组织中 VE-cadherin信号定量分析，并根据ADM+细胞比例对hGBM组织进行分层。

通过VE-cadherin, cadaverine 和 laminin的多重免疫染色，使用StrataQuest软件，分别定量出hGBM-3异种移植物和小鼠正常大脑中的cadaverine积液区面积和VE-cadherin+血管的百分比。验证了AMA在肿瘤移植物中恢复了VE-钙粘蛋白的表达，保留了内皮连接，减少了cadaverine积液，但对小鼠正常脑血管系统的影响可以忽略不计。通过Pimo和Dox的免疫染色，使用StrataQuest软件，定量异种移植物中Pimo+和Dox +肿瘤区域的百分比。结果显示AMA治疗减少了肿瘤缺氧并增强了药物传递，在接受AMA的异种移植物中，吡唑标记的缺氧区域显著减少，阿霉素灌注区域增加。

Figure 5 AMA治疗提高了dabrafenib的给药效果和治疗效果

（A 和 B）BRAF 突变体 hGBM 中 VE-钙粘蛋白、CD31 和 ADM （B） 的 H&E 染色 （A） 和免疫染色。坏死区域和坏死周围区域的血管分别用虚线和箭头突出显示。比例尺，100 微米 （A） 或 25 微米 （B）。

通过对BRAFV600e突变体hGBMs组织进行 VE-cadherin 、CD31和ADM 的多重免疫染色和多重荧光图像获取，观察到该组织表现出明显的坏死，缺乏VE-钙粘蛋白，并且有丰富的血管和大量产生ADM的TAMs。